Génétique, infections et biologie moléculaire [54]

Face à l’infection de quelque nature qu’elle soit, chaque individu tout en ayant un mécanisme commun de défense, présente des variabilités génétiques non pathologiques (les polymorphismes) pouvant dans certains cas les rendre soit plus susceptibles (plus « fragiles ») soit plus résistants à certaines agressions microbiennes. On parle de facteurs génétiques liés à l’hôte. Les gènes impliqués sont essentiellement des gènes impliqués dans la réponse

inflammatoire, la reconnaissance de l’agent infectieux et dans la coagulation. L’hypothèse de facteurs génétiques impliqués dans la résistance ou non à des infections est partie de plusieurs observations cliniques telles par exemple que la résistance au paludisme grave des sujets atteints de drépanocytose. Des études sur jumeaux ont pu aussi démontrer le lien entre la génétique et la susceptibilité potentielle aux infections. La plupart des polymorphismes retrouvés impliqués dans la susceptibilité ou la résistance aux infections présentent des effets de sensibilité ou de protection mineurs. En fait, la réponse globale de sensibilité-résistance aux infections correspond à des effets additionnels/soustractifs/synergiques/d’interactions entre de multiples facteurs. Il s’agit de la résultante d’interactions complexes que seuls, quelques polymorphismes ne peuvent expliquer. La réponse à l’infection, quel que soit son sens, est trop complexe pour ne se résumer qu’à quelques variant alléliques. L’étude des facteurs génétiques impliqués dans la résistance ou la sensibilité aux infections n’en est donc qu’à ses débuts (domaine de la recherche) et ne présente pas d’intérêt pour le clinicien à ce jour. Il est probable cependant que prochainement, la recherche de plusieurs polymorphismes présents dans un ou plusieurs gènes soit effectuée en parallèle de la mise en évidence de l’agent infectieux causal. Cette carte polymorphique pourra alors par exemple établir un profil de résistance ou de sensibilité à tel ou tel agent infectieux permettant ainsi d’adapter la prévention (vaccination par exemple) ou d’établir le meilleur traitement (domaine de la pharmacogénétique). L’annexe 2 donne de manière simplifiée quelques exemples.

10. Perspectives d’évolution du diagnostic moléculaire en bactériologie : 10.1. Appareillage [54]

Sur le plan technique et technologique, la biologie moléculaire est en constante évolution et de nouveaux appareils plus rapides, plus compacts sont commercialisés. Il est donc impossible d’être exhaustif sur ce sujet et nous n’aborderons que quelques points généraux. Nous avons déjà évoqué dans les paragraphes précédents certaines évolutions concernant la rapidité des thermocycleurs ou l’évolution des techniques de recherche des AN (avec ou sans amplification de cible) (tableau 20). Le regroupement des laboratoires en pôles, la centralisation sur certains hôpitaux ou laboratoires privés de certaines recherches sont en cours. Le développement d’automates/robots de plus en plus performants est aussi en cours.

Pour accélérer la recherche d’agents pathogènes, outre le développement de techniques de recherche et détection des AN, de véritables plateformes permettant d’analyser plusieurs échantillons en parallèle sont à l’étude. Ces appareils sont réservés aux grandes séries. Néanmoins, dans le contexte d’épidémies, on peut imaginer que celles-ci pourraient être utiles dans un contexte d’urgence. Certaines machines permettent ainsi l’analyse de 384 échantillons en parallèle par PCR en temps réel et donnent un résultat en 35 minutes. D’autres systèmes permettent l’analyse par PCR multiplex. D’autres systèmes miniaturisés permettent l’analyse de 1536 échantillons (20 nl à 10 μl distribués par un robot en moins de deux minutes). Bien que ces systèmes n’aient pas encore été utilisés pour les recherches d’agents pathogènes, on peut s’attendre à un développement proche.

Par ailleurs, le développement de la portabilité des thermocycleurs laissent penser que la biologie moléculaire sera réalisable non seulement en milieu hospitalier ou en laboratoire privé mais aussi en milieu éloigné comme par exemple, la brousse.

10.2. Miniaturisation [87]

La miniaturisation des automates progresse grâce aux nanotechnologies. La littérature décrit régulièrement de véritables laboratoires sur puces (« lab-on-a-chip ») de la taille d’une carte de crédit comme la LabChip^® (Caliper) et LabCard^TM (ACLARA Biosciences) ont miniaturisé les tests de dosage et de détection et offrent maintenant un génotypage à haut débit. Récemment, un biopuce autonome, entièrement intégrée a été développé pour la préparation des échantillons (capture des cellules basée sur les billes magnétique, préconcentration cellulaire, purification et lyse), la PCR et la détection d’ADN sur microarray avec l'hybridation et le suivi électrochimique. La biopuce en plastique mesure 60 × 100 × 2 mm et se compose de mélangeurs microfluidique, de microvannes actionnées thermiquement à base de paraffine, pompes thermopneumatic, les canaux, les chambres, chauffage, capteurs et des puces à ADN. Par exemple, l’utilisation de particules d’or ou de nanopores dans l’approche diagnostique a été décrite.

Dans certains cas, des nanoparticules d'or sont impliqués dans les diagnostics basés sur l’ADN (figure 34), dans une application avancée avec une amplification du signal pour ADN ou ARN, le test Bio-Bar-Code, un dispositif POC prototype qui est la moitié de la taille d'une carte de crédit a déjà été développé.

Figure 34 : Représentation schématique de la détection par hybridation d’ADN avec les nanobarreaux d’or. La reconnaissance spécifique de la cible induit l’agrégation des nanobarreaux d’or [88].

Des nanopores conçus représentent une autre approche basée sur l'observation que les nucléotides individuels passent seuls à travers un nanopore de 2,6 nm en diamètre en utilisant des champs électriques. Le débit de l'ADN à travers ces nanopores (nanopores d’ADN) est ensuite utilisé pour discriminer entre les chaînes d'ADN qui ne diffèrent que par une seule paire de bases. Les nanopores permettent de déchiffrer les chaînes d'ADN individuelles jusqu'à 30 nucléotides. Les nanopores à résolution d’un seul nucléotide ont également montré pour être utiles pour le séquençage ultrarapide à des taux dépassant 1000 bases / s. Les nanopores ont donc le potentiel pour le développement de nanodispositifs à faible coût et à haut débit pour l'analyse des polynucléotides de l'ADN, mais les applications commerciales ne sont pas encore disponibles.