Différents outils génétiques sont actuellement utilisés en hématologie clinique : le caryotype, l’hybridation in situ en fluorescence (FISH), la réaction en chaîne entraînée par une polymérase à ADN après transcription inverse (RT-PCR) ainsi que la cytométrie en flux (index d’ADN) (16, 112, 113). Les différentes caractéristiques de ces techniques sont présentées au Tableau VI.
Caryotype
Dans les hémopathies malignes, le caryotype permet l’analyse des anomalies chromosomiques spécifiques aux cellules leucémiques. Les lymphocytes étalés sur des lames sont colorés un marquage morphologique en bandes GTG (bandes G, dénaturation à la Trypsine et coloration au Giemsa), permettant d’identifier chacune des 23 paires de chromosomes. La résolution obtenue varie entre 10 et 20 Mb (114). Ceci donne une vue d’ensemble du génome (analyse non ciblée) (98, 114) et permet la détection des anomalies récurrentes, rares et secondaires, qu’elles soient équilibrées ou déséquilibrées. Le caryotype vise les cellules en phase mitotique et présente des difficultés techniques telles qu’un faible index mitotique des cellules leucémiques in vitro et une faible résolution des chromosomes (Tableau VI) (98, 114, 115). Le Collège Canadien des Médecins Généticiens (CCMG) recommande de détecter les anomalies chromosomiques clonales par la technique du caryotype pour tous les cas de LAL et de LAM de novo, ainsi que pour le suivi et à la rechute si une anomalie est identifiée au diagnostic (116).
Hybridation in situ en fluorescence (FISH)
La technique d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) permet d’hybrider une sonde fluorescente avec une séquence d’ADN complémentaire sur les noyaux interphasiques (FISH interphasique) ou les cellules mitotiques (FISH métaphasique) du patient (16, 114). En cytogénétique hématologique, la FISH constitue un outil essentiel pour établir le diagnostic et le pronostic des leucémies (98, 108, 115, 117). Il existe une grande variété de sondes commerciales, principalement les sondes de fusion (pour la détection d’un gène de fusion) et les sondes de réarrangement (breakapart, pour la détection d’un réarrangement génique) (98, 112). Ces dernières sont surtout utilisées pour les gènes ayant un grand nombre de partenaires tel que MLL (112, 115, 118).
Pour le diagnostic des leucémies de novo, les laboratoires de cytogénétique clinique utilisent généralement une série « panel » de sondes spécifiques aux anomalies chromosomiques les plus fréquentes et/ou ayant une valeur pronostique importante selon le type de leucémie étudié. Toutefois, certains gènes ne sont pas couverts par une sonde commerciale (sondes utilisées dans les panels) et nécessitent une petite sonde ciblant une région génomique précise. Il est alors approprié d’utiliser des chromosomes artificiels de bactéries (Bacterial artificial chromosomes-BACs) ayant une taille d’environ 150-300 kb, permettant de cibler des séquences uniques au niveau d’un gène spécifique (16). Les BACs sont d’ailleurs particulièrement utiles pour préciser les points de cassure d’une translocation chromosomique rare (119). Pour caractériser les remaniements chromosomiques complexes ou pour identifier les chromosomes marqueurs d’origine inconnue, il est pertinent d’effectuer une FISH métaphasique (sur chromosomes) avec des peintures chromosomiques (ensemble de sondes à séquences uniques spécifiques à chaque paire de chromosomes homologues).
Réaction en chaîne entraînée par une polymérase à ADN après
transcription inverse (RT-PCR)
La RT-PCR est une analyse qui utilise des amorces spécifiques à une séquence d’ARN du patient, puis plusieurs cycles d’amplification sont effectués. La RT-PCR est une technique spécifique et très sensible (10-6) (98, 112, 118, 120), d’où l’augmentation du risque d’un résultat faux positif (contamination avec des produits PCR) (120, 121). Puisqu’en clinique, la RT-PCR est utilisée pour détecter les transcrits des gènes de fusion les plus fréquents, elle présente l’inconvénient du risque de résultats faux négatifs (dû à des translocations variantes avec des points de cassures moléculaires rares) (59, 98). Enfin, cette méthode ne permet pas la détection d’aneuploïdies telles que les trisomies et les monosomies ainsi que les anomalies de ploïdie telle que l’haploïdie et l’hypodiploïdie.
Index d’ADN
L’index d’ADN (cytométrie de flux) permet d’évaluer la ploïdie d’un échantillon en mesurant la quantité d’ADN par cellule (112). L’ADN est marqué avec un fluorochrome (l’iodure de propidium) qui émet de la fluorescence en présence d’une lumière laser émise par le cytomètre de flux. Un algorithme permet ensuite de distinguer les différentes phases du cycle cellulaire (G0, G1/S et G2/M) et de les comparer à un contrôle normal diploïde
(index d’ADN = 1) (94). L’hyperdiploïdie (plus de 50 chromosomes) entraîne un bon pronostic et est caractérisée par un index d’ADN > 1,16, alors que l’hypodiploïdie sévère (moins de 39 chromosomes) amène un pronostic défavorable et est représentée par un index d’ADN < 0,85 (94, 95, 122).
Tableau VI. Comparaison des avantages et des limites de chacune des techniques
cytogénétiques actuellement utilisées pour le diagnostic des leucémies.
Technique Avantages Limites
Caryotype
(98, 114, 115)
Analyse génomique globale Faible résolution (environ 10 Mb)
Détection des anomalies chromosomiques numériques (aneuploïdie et polyploïdie) et
structurales (anomalies fréquentes et rares)
Cible uniquement les cellules en division et nécessite une quantité et
une qualité adéquate des métaphases FISH
(16, 112, 115, 117)
Détection des anomalies chromosomiques numériques et structurales (permet la
détection des anomalies cryptiques)
Analyse ciblée
Cible à la fois les mitoses et les noyaux interphasiques
Résolution environ 100 kb
Détection de l’hétérogénéité clonale Nécessite l’utilisation de plusieurs
sondes RT-PCR
(59, 98, 118, 120, 121)
Sensibilité permettant la détection de la maladie résiduelle
Analyse ciblée (détection des transcrits des gènes de fusion
fréquents)
Ne détecte pas les anomalies chromosomiques numériques et
structurales rares
Taux élevés de faux positifs et de faux négatifs
Index ADN
(95, 112)
Détection des changements de ploïdie, de l’hyperdiploïdie et de l’hypodiploïdie
Seuil de détection élevé Ne détecte pas les anomalies de
structure et les aneuploïdies impliquant 1 ou 2 chromosomes aCGH
(114, 123, 124)
Détection des réarrangements cryptiques déséquilibrés
(gains et pertes)
Détection des LOH à la suite d’une perte d’un allèle sans duplication compensatoire
Ne détecte pas les anomalies équilibrées
Ne détecte pas les CN-LOH, la ploïdie et les petits clones aSNP
(125-127)
Détection des réarrangements cryptiques déséquilibrés (gains et pertes) Détection des LOH, des CN-LOH, de la
ploïdie et de l’hétérogénéité clonale
Ne détecte pas les anomalies équilibrées