Techniques biochimiques

III.1 Production des protéines recombinantes en grand volume

50 ml de LB contenant l'antibiotique approprié sont inoculés à partir des stocks glycérolés de

E. coli BL21(DE3)RIL ou STAR et cultivés 16h à 37°C afin de servir de préculture. Celle-ci

est ensuite transférée dans 1L de TB contenant l'antibiotique approprié et incubée à 37°C jusqu'à une DO600nm approximative de 0,5. La surexpression des protéines d'intérêt est induite

par l'ajout d’IPTG 0.5 mM pendant 3 heures à 37°C. Les cultures sont ensuite centrifugées 10 minutes à 4000 rpm. Les culots bactériens sont repris dans 50mL de tampon A (50 mM HEPES pH 7,5 / 200 mM NaCl / 20 mM Imidazole) contenant 1 pastille de Complete EDTA- free (Roche) et lysés par sonication. Les lysats sont ensuite centrifugés 20 minutes à 18000 rpm et le surnageant conservé pour purification.

III.2 Production des protéines recombinantes en mini-cultures

Toutes les protéines recombinantes destinées aux analyses des co-expressions ont été purifiées en parallèle sur des plaques multi-puits.

4 ml de LB contenant l'antibiotique approprié sont inoculés à partir des stocks glycérolés de

E. coli STAR et cultivés 16h à 37°C afin de servir de précultures. 100µl de chacune des

précultures sont ensuite transférées toujours en plaque multi-puits dans 4ml de TB contenant l'antibiotique approprié et incubés à 37°C durant 2 heures. La surexpression des protéines d'intérêt est induite par l'ajout d’IPTG 0.5 mM pendant 3 heures. Les cultures sont ensuite centrifugées 10 minutes à 4000 rpm. Les culots bactériens sont lysés chimiquement durant 20 minutes par 1 ml de BugBuster® 1X (Novagen) dilué dans du tampon A (50 mM HEPES pH7,5 / 200 mM NaCl / 20 mM Imidazole) et supplémenté de 2µl de r-lyzozyme (Novagen) et 0.8 µl de benzonase nucléase (Novagen). Les lysats bactériens sont clarifiés par une nouvelle centrifugation puis les surnageants conservés pour purification.

III.3 Purification des protéines recombinantes

Les purifications des protéines, pour leur étude individuelle, ont été réalisées par chromatographie d’affinité au nickel sur une colonne HisTrap de 1 ml (Amersham), le lavage est effectué avec 45ml de Tampon A (50 mM HEPES pH7,5 / 200 mM NaCl / 20 mM

sont analysées par électrophorèse sur gel polyacrylamide en conditions dénaturantes (pourcentage du gel polyacrylamide variable de 7.5% à 15% selon la protéine considérée). Les fractions contenant les protéines d'intérêt sont rassemblés et dialysées une nuit contre un Tampon C (50 mM HEPES pH7.5 / 50 mM NaCl).

En fonction des analyses réalisées sur les protéines recombinantes l’étiquette poly-histidine peut-être clivée par l’utilisation de protéase Tev (Tobacco Etch Virus) produite au laboratoire. Le clivage à lieu durant 2 heures à un ratio 3 :1 (protéine :Tev) et les protéines d’intérêts sont séparées de la Tev par une nouvelle chromatographie d’affinité Nickel.

La dernière étape de purification est réalisée par chromatographie d’exclusion (Filtration sur gel préparative S200 Superdex HR de 120 ml).

Cas particuliers : purifications des complexes nécessitant des étapes supplémentaires - Purification du complexe RrgB-RrgC catalysé par SrtC-1

Après chromatographie d’affinité au nickel sur une colonne HisTrap de 5 ml (Amersham), les fractions contenant le complexe RrgB-RrgC sont rassemblées, dialysées contre un tampon D (50mM MES pH6.0 / 50 mM NaCl) et soumis à une chromatographie sur une colonne Ressource-Q 6 ml échangeuse d’anions (GE-Healthcare). L’élution est réalisée par un gradient de sels (NaCl 50-250 mM). Une dernière étape de chromatographie d’exclusion (S200 Superdex, GE Healthcare) est réalisée dans un tampon E (50mM MES pH6.0, 150mM NaCl). La quantité finale de complexe purifié obtenue est de l’ordre de 500 µg par litre de culture.

- Purification du complexe acyl-enzyme RrgC*SrtC-3

Après chromatographie d’affinité au nickel sur une colonne HisTrap de 5 ml (Amersham), les fractions contenant le complexe RrgC*SrtC-3 sont rassemblées, dialysées contre un tampon F (50mM HEPES pH7.0 / 50 mM NaCl) et soumis à une chromatographie sur une colonne Ressource-Q 6 ml échangeuse d’anions (GE-Healthcare). L’élution est réalisée par un gradient de sels (NaCl 50-250 mM). Une dernière étape de chromatographie d’exclusion (S200 Superdex, GE Healthcare) est réalisée dans un tampon G (50mM HEPES pH7.0, 150mM NaCl). La quantité finale de complexe purifié obtenue est de l’ordre de 1 mg par litre de culture.

III.4 Minipurification des surnageants de co-expressions

Les surnageants provenant des mini-cultures des co-expressions, soit environ 750µl, sont purifiés sur le sytème His-MultiTrap® HP-columns (GE Healthcare). Ce système en plaque présente 96 mini-colonnes contenant chacune une résine Nickel sepharose haute performance, permettant ainsi de réaliser les mini-purifications en parallèle. Les colonnes sont lavées 2 fois par du tampon A avant le dépôt des surnageants bactériens qui est suivi de trois étapes de lavage par du tampon A. Les protéines d’intérêt sont éluée en une seule étape par ajout de 200 µl de tampon B.

III.5 Analyses des protéines

III.5.1 Analyse des protéines par électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS- PAGE)

Les échantillons protéiques sont incubés avec une solution de bleu Laemmli de concentration finale 1X (Composition 1X : 62.5mM Tris pH6.8 / 2% SDS / 650 mM β-mercaptoéthanol / 10% glycérol / 0.1% bleu de bromophénol) puis chauffés à 100°C durant 10 minutes. Les échantillons sont ensuite chargés sur des gels de polyacrylamide dont le pourcentage en Acrylamide/Bisacrylamide est variable en fonction de la protéine analysée : 7.5 à 15% ou sur des gels commerciaux Criterion XT precast gel (Biorad) qui présentent un gradient Bis-Tris de 4-12% permettant de conserver une bonne résolution tant pour les complexes de hauts poids moléculaires que pour les petites protéines. La migration est réalisée à 200V soit dans un tampon d’électrophorèse 1X réalisé au laboratoire (Tris 25mM / SDS 0.1% / Glycine 192mM) soit dans le tampon MOPS commercialisé par Biorad.

III.5.2 Coloration des protéines au bleu de Coomassie

Le gel de protéine est plongé durant 30 minutes dans une solution de coloration de composition suivante: éthanol 50%, acide acétique 8%, 0.25% Coomassie R250. Celui-ci est ensuite rincé à l’eau et décoloré par une solution de décoloration composé par de l’éthanol 5% et de l’acide acétique 7.5%.

III.5.3 Transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose

III.5.4 Immunorévélation des protéines sur membrane de nitrocellulose

Les membranes de nitrocellulose sont saturées dans une solution de PBS Tween 0.3% contenant 5% lait durant une heure.

- Pour une détection His-Tag : La membrane de nitrocellulose est incubée durant 1 heure avec des anticorps anti-His-Tag couplés à la HRP (Horse Radish Peroxydase commercialisé par SIGMA) utilisés au 1/50000ème dans une solution de PBS Tween 0.3% contenant 5% lait.

- Pour une détection anti-RrgA, anti-RrgB ou anti-RrgC : La membrane de nitrocellulose est incubée durant 1h30 avec des anticorps primaires polyclonaux anti-RrgA, Anti-RrgB ou anti-RrgC qui ont été produits chez des souris. Ces anticorps sont utilisés au 1/5000ème dans une solution de PBS Tween 0.3% contenant 5% lait. Après 3 lavages au PBS Tween 0.3%, la membrane est incubée durant 1h avec des anticorps secondaires anti-souris couplés à la HRP utilisés au 1/120000ème dans une solution de PBS Tween 0.3% contenant 5% lait.

- Pour une détection anti-SrtC-1, anti-SrtC-2 ou anti-SrtC-3 : La membrane de nitrocellulose est incubée durant 1h30 avec des anticorps primaires polyclonaux anti-SrtC-1, Anti-SrtC-2 ou anti-SrtC-3 qui ont été produits chez des lapins. Ces anticorps sont utilisés au 1/2000ème dans une solution de PBS Tween 0.3% contenant 5% lait. Après 3 lavages au PBS Tween 0.3%, la membrane est incubée durant 1h avec des anticorps secondaires anti-lapin couplés à la HRP utilisés au 1/10000ème dans une solution de PBS Tween 0.3% contenant 5% lait.

Les membranes de nitrocellulose sont ensuite lavées 3 fois par une solution de PBS Tween 0.3%, puis révélées par chimioluminescence (ECL, Amersham).

III.5.7 Tests de stabilité par protéolyse à la trypsine et séquençage N-terminal 20µg de chaque protéine purifiée est mélangé à 50 ng de Trypsine (Sigma) et la digestion enzymatique à lieu à température ambiante durant 16 heures. Les échantillons sont ensuite chauffés à 100°C durant 10 minutes en présence de bleu laemmli 1x puis analysés par SDS- PAGE. Les protéines sont soit colorées par une solution de bleu de Coomassie soit électro- transférés sur une membrane Problott® (applied Biosystems) puis colorées selon les instructions du fournisseur. Les bandes à analyser ont été excisées des membranes Problott® et le séquençage N-terminal a été réalisé au Laboratoire d’enzymologie Moléculaire de l’IBS par Jean-Pierre Andrieu.

III.5.8 Tests de stabilité par Thermal Shift Assay (TSA)

Les expériences de TSA sont réalisées à l’aide d’un instrument commercialisé par BioRad qui se compose d’un module IQ5 couplé à un thermocycleur. Cet instrument permet de suivre en temps réel l’évolution de fluorescence d’échantillons, protéiques dans notre cas, dans un format de plaque 96 puits (le principe de la technique est décrit ci-dessous).

25ng de chacune des protéines purifiées RrgA, RrgB et RrgC ainsi que leurs variants sont mélangés à 2 μl de Sypro Orange 100x (sonde moléculaire) dans un volume final de 25µl. Chaque expérience est réalisée en triplicat. Les échantillons sont ensuite dénaturés à raison de 1°C par minute (20-95°C) et la fluorescence émise par la sonde fluorescente est mesurée tout au long de l’expérience.

IV Principes

IV.1 Principe du Thermal Shift Assay

Le thermal Shift Assay (TSA) est une méthode qui permet d’étudier la stabilité thermique d’une protéine purifiée. Le principe de la méthode consiste à mélanger l’échantillon protéique avec un fluorophore, le Sypro Orange, qui se fixe et ne fluoresce que dans un environnement hydrophobe. L’échantillon est chauffé progressivement, à raison de 1 °C / min. A basse température, la protéine est repliée, ne présentant à sa surface que des résidus hydrophiles. Lorsque la température de fusion Tm de la protéine (pour melting temperature) est atteinte, la protéine se dénature, exposant ses résidus hydrophobes sur lesquels le Sypro Orange se fixe et fluoresce. Le Tm est défini comme le point d’inflexion de la courbe schématisée figure 37. Afin d’extraire facilement le Tm la dérivée première de la courbe est calculée. Au Tm, la courbe obtenue présente un minimum. Si plusieurs espèces se trouvent en solution ou si la protéine est multi-domaines, il est possible d’observer plusieurs Tm différents (Pantoliano 2001, Geerlof 2006).

Fluorescence