Modèles d’assemblage du pilus chez S pneumoniae

Chez le pneumocoque, l’organisation générale du pilus reste controversée puisque quatre modèles ont été proposés depuis 2006, date de la première publication décrivant le pilus (Barocchi 2006). Les deux premiers modèles ont été conçus à partir de l’observation des pili en surface de la bactérie. Les deux suivants sont issus de l’analyse de pili natifs purifiés.

En 2006, Barocchi et ses collaborateurs proposent le premier modèle de cette structure à partir de clichés de microscopie électronique à transmission couplée à l’immunomarquage de chacune des pilines (Barocchi 2006). RrgA parait localisée à la surface bactérienne suggérant que cette piline accessoire a une fonction d’ancrage du pilus. Les anticorps anti- RrgB décorent toute la longueur de la fibre, ce qui est en accord avec le rôle de piline majeure de la protéine. La piline mineure RrgC est localisée à l’extrémité distale du pilus (Fig.23 et Fig.27 modèle1).

Figure 23: Immuno-localisation des pilines du PI-1 de S. pneumoniae. E. Cliché de MET d’une bactérie S.

pneumoniae TIGR4 immunomarquée par des anticorps α-RrgA visualisés à l’aide d’anticorps secondaires

couplés à des particules d’or. F. Cliché de MET d’une bactérie S. pneumoniae TIGR4 immunomarquée par des anticorps α-RrgB (5 nm) et α-RrgC (10 nm). G. Plus fort grossissement d’une bactérie S. pneumoniae TIGR4 immunomarquée par des anticorps α-RrgB (5 nm) et α-RrgC (10 nm) (Les flèches indiquent le marquage anti- RrgC). L’échelle représente une distance de 200 nm (Barocchi et al. 2006)

La même année, le groupe de Camilli réalise des expériences très similaires, mais présente des résultats divergents au modèle 1, notamment en ce qui concerne la localisation de RrgA (Fig.24et Fig.27 modèle 2) (LeMieux 2006). Dans ce cas en effet, plusieurs molécules de RrgA sont regroupées, et ces organisations sont distribuées périodiquement le long de la fibre RrgB. De plus, sa localisation à la membrane n’est visualisée que chez un mutant TIGR4ΔrrgBC, n’exprimant ni RrgB et ni RrgC (LeMieux 2006). Dans ce travail, la

localisation de RrgC n’a pas été étudiée et n’est donc pas incluse dans le modèle 2 présenté Figure 27.

Figure 24: Immuno-localisation des pilines RrgA et RrgB du PI-1 de S. pneumoniae. Cliché de MET d’une

bactérie S. pneumoniae TIGR4 immunomarquée par des anticorps α-RrgB révélés par des anticorps secondaires couplés à des billes d’or de 18 nm et par des anticorps α-RrgA révélés par des anticorps secondaires couplés à des billes d’or de 12 nm. Les flèches indiquent le marquage RrgA. L’échelle représente une distance de 0.5µm (LeMieux et al. 2006)

En 2008, Hilleringmann et ses collaborateurs analysent l’assemblage des pilines à partir de pili extraits et purifiés (Hilleringmann 2008). L’observation de ces structures par microscopie électronique à transmission couplé à un triple immunomarquage montre l’association des fibres RrgB en protofilament de 3.5 nm de diamètre, sur lesquels sont associés des groupements de RrgA (Fig. 25 et Fig. 27, modèle 3). RrgC est également distribuée le long des fibres RrgB, associée ou non aux clusters de RrgA. Ce troisième modèle est en accord avec le modèle 2.

Figure 25: Immuno-localisation des pilines RrgA, RrgB et RrgC sur des pili purifiés provenant de la souche S. pneumoniae TIGR4. Les pili purifiés ont été incubés avec des anti-sera dirigés contre RrgA, RrgB et

RrgC conjugés respectivement à des particules d’or de 15 nm, 5 nm et 10 nm. L’échelle représente une distance de 100 nm (Hilleringmann et al. 2008)

compris entre 7 et 9.5 nm, en accord avec les tailles des pili mesurés à la surface des bactéries (Barocchi 2006, LeMieux 2006, Hilleringmann 2008) (Fig. 27,modèle 3).

Enfin en 2009, la même équipe révise son modèle en se basant sur une analyse des pili purifiés, et des sous-unités isolées, par STEM (Scanning Transmission Electron Microscopy) (Hilleringmann 2009) (Fig.26et Fig.27, modèle 3).

Figure 26: Immunolocalisation des pilines mineures RrgA et RrgC à partir de pili natifs purifiés de la souche TIGR4. A. Analyse par ME en coloration négative des pilines recombinantes produite chez E.coli. La

barre d’échelle représente une longueur de 10 nm. B. Immuno-localisation des pilines mineures RrgA (1) et RrgC (2). Les flèches noires permettent de visualiser la polarité des fibres grâce à la protrusion latérale des pilines RrgB. La flèche blanche indique les groupements d’anticorps marquant les pilines accessoires. La barre d’échelle représente une longueur de 20 nm (Hilleringmann et al. 2009).

L’association en super hélice des protofilaments observés lors de l’étude précédente est interprétée comme un artefact de la préparation, non homogène, des fibres de pili. L’optimisation des protocoles de préparation des échantillons bactériens, de purification des pili, et des méthodes de coloration négative ainsi que l’amélioration de la résolution en microscopie électronique permettent d’observer et d’analyser des pili individuels, non plus associés en « coiled-coil », aussi bien à la surface du pneumocoque qu’à partir de préparations de pili purifiés (Hilleringmann 2009). Des expériences d’immunomarquage avec des anticorps dirigés contre chacune des pilines sont réalisées sur ces fibres individuelles. La technique de microscopie électronique employée (STEM) permet d’observer directement les Ig : la haute résolution ainsi atteinte permet de montrer de façon non ambiguë que RrgB forme la fibre du pilus et que RrgA et RrgC sont chacunes présentes à une extrémité de la fibre (Hilleringmann 2009) (Fig. 26, B). L’orientation de la fibre native est définie dans ces travaux par l’analyse

structurale des sous-unités recombinantes purifiées, en employant le même outil de microscopie électronique (Hilleringmann 2009) (Fig. 26, A). RrgA est formé d’un chapelet flexible de quatre petits domaines d’une longueur totale approximative de 18 nm. La protéine recombinante RrgB a la forme d’un haricot de 12 nm de long et présente une protrusion latérale. Enfin, RrgC la plus petite des trois pilines semble être composé de 2-3 domaines et présente une longueur approximative de 10 nm (Fig. 26, A). Ainsi, basé sur ces informations et sur l’analyse des pili natifs purifiés, Hilleringmann et ses collaborateurs proposent que la fibre du pilus est composée d’approximativement 150 monomères de RrgB qui se chevauchent légèrement et dont l’orientation est définie grâce à la protrusion latérale de la piline majeure. Cette observation permet également de montrer qu’un monomère de RrgA est localisé à l’extrémité distale de la fibre et un monomère de RrgC du côté proximal (Hilleringmann 2009) (Fig. 26, B). Ce quatrième modèle est plus en adéquation avec les données recueillies concernant les pilines accessoires. RrgA est l’adhésine du pilus, il parait donc important qu’elle soit présente à l’extrémité distale de la fibre pour faciliter l’adhésion du pilus aux cellules hôtes, bien que sa localisation le long de la fibre puisse augmenter l’avidité d’une telle interaction. La position de RrgC à la base du pilus permet d’envisager une fonction dans l’ancrage du pilus à la paroi bactérienne, comme le suggère le phénotype de la souche mutante TIGR4ΔrrgC, dans laquelle les pili se détachent plus facilement de la surface bactérienne et sont retrouvés en quantité plus importante dans le milieu de culture (Hilleringmann 2009).

Figure 27: Modèles de l’organisation générale des pili du pneumocoque. Les modèles 1 et 2 sont basés sur