Technique SIMS

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ainsi :

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 .

On aboutit ainsi sur une relation qui relie la fréquence et le rapport m/z de l’ion. Avec : f : la fréquence cyclotronique en Hertz ;

B : le champ magnétique en Tesla ; e : la charge élémentaire en Coulombs : m : la masse de l’ion en kilogramme ; z : la charge de l’ion.

Exemple avec un champ magnétique de 9,4T :

Un ion de masse 300uma aura une fréquence cyclotronique d’environ 481 177Hz.

VIII.4 Technique SIMS

La Spectrométrie de Masse d’Ions Secondaires (SIMS) est une technique d’analyse physico-chimique de l’extrême surface. Elle est basée sur la détection des particules chargées (ions secondaires) produits sous l’effet d’un bombardement d’ions incidents (ions primaires). La nature des ions secondaires émis est intimement liée à celle de la surface de l’échantillon. De plus, les ions secondaires ne peuvent provenir que de l’extrême surface (10Å) ce qui fait du SIMS une des techniques les plus sensibles à la surface. Le phénomène SIMS est suffisamment général pour pouvoir analyser tout type de surface, les seules contraintes concernent les échantillons non compatibles avec l’ultravide. Les applications du SIMS sont

111 donc nombreuses : analyse élémentaire et moléculaire, profil en profondeur, imagerie ionique, identification chimique etc.

Dans notre étude, la technique du SIMS a été testée sur des coupes semi-fines de pellicules de baie de raisin de la parcelle 3, Cabernet-sauvignon, au stade fermeture de grappe du millésime 2008. Les analyses ont été effectuées par le département des Sciences des matériaux et des procédés, PCPM, dirigé par Arnaud Delcorte, de l’unité de physico-chimie et de physique des matériaux de l’Université catholique de Louvain, Belgique.

IX.

Analyse statistique

Dans ce travail, différents logiciels de statistiques ont été utilisés. Les statistiques paramétriques (ANOVA, ACP, Test t de Student) ont été réalisées à l’aide du logiciel Statistica. Un grand nombre de données concernaient de petits échantillons, ainsi les statistiques non paramétriques ont été réalisées avec les utilitaires de l’association Anastat. Enfin pour les données sensorielles, une partie des traitements ainsi que l’analyse sensorielle descriptive (NF EN ISO 13299) a été directement réalisée avec le logiciel de dégustation FIZZ.

X.

Analyse et traitement des images

En microscopie photonique, les images ont été reconstituées par le logiciel Leica du microscope confocal SP2, puis déconvoluées et reconstituées en 3D par les logiciels

112

C

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Dans la baie de raisin, les tannins sont localisés dans les pépins et les pellicules. Leur étude, relativement récente par rapport aux travaux réalisés sur l’ensemble des composés phénoliques, apporte principalement des données chimiques et biochimiques. Peu de données concernent leur localisation spécifique dans la cellule, leur mode de transport ou leur mode de liaison avec d’autres composés cellulaires.

Dans les pépins, seules des procyanidines sont présentes : (+)-catéchine, (-)-épicatéchine et (-)-épicatéchine-3-O-gallate (Su et Singleton, 1969), alors que dans les pellicules, ces monomères sont présents ainsi que la prodelphinidine (-)-épigallocatéchine (Kennedy et al., 2001). Dans la pellicule (Amrani Joutei et Glories, 1994), les tannins peuvent être :

∼ libres dans le suc vacuolaire, sous forme granuleuse ou sous forme d’amas plus ou moins grands surtout localisés au niveau du tonoplaste,

∼ liés aux protéines et aux polysaccharides des membranes vacuolaires,

∼ liés aux parois et plus spécifiquement aux polysaccharides pariétaux.

Les teneurs en tannins dans le péricarpe décroissent généralement des cellules de l’épiderme à celles de la pulpe dont les parois en sont dépourvues, à l’exception de quelques cellules du faisceau vasculaire (Amrani Joutei et al., 1994). Un gradient de condensation a également été observé du mésocarpe vers l’épiderme : dans les couches profondes de la pellicule, les tannins sont peu condensés et localisés dans de petites vacuoles tandis que vers la périphérie, la taille des vacuoles et la condensation des tannins augmentent. Par ailleurs, la présence de tannins dans les parois suggère un transport intercellulaire. L’hypothèse d’une

113 migration centrifuge des tannins a été émise pour expliquer ce phénomène, les monomères subissant un transport apoplasmique ou symplasmique (Amrani Joutei, 1993).

Les derniers travaux de Gagné et al. (2006b), sur les tannins pelliculaires, ont mis en évidence une localisation majoritaire dans la fraction intracellulaire et seulement 10% des tannins totaux de la pellicule seraient associés aux parois. De plus, quelle que soit la localisation des tannins, la composition est relativement constante au cours du développement avec seulement quelques différences au niveau des unités terminales des polymères (les unités terminales de la fraction pariétale sont plus riches en prodelphinidine), suggérant des capacités d’interactions des tannins différentes, en fonction de leur localisation. De plus, le degré de polymérisation des tannins pariétaux étant plus élevé que celui des tannins de la fraction intracellulaire, ces résultats complètent les travaux d’Amrani Joutei en 1993 et 1994, et émettent l’hypothèse d’une condensation des tannins pariétaux par polymérisation et d’une condensation des tannins intracellulaires par auto-association des amas granuleux visibles dans la vacuole.

Ainsi, si maintenant il est admis qu’une partie des tannins pelliculaires peuvent être localisés dans les parois, aucunes données ne permettent d’expliquer comment ils se lient aux composés pariétaux et par quels types de liaison.

L’objectif de ce chapitre est donc d’étudier les tannins pariétaux en combinant une approche biochimique et microscopique afin d’apporter des éléments nouveaux sur les modes de liaison des tannins avec certains composés pariétaux. Pour ce travail, deux approches innovantes ont été utilisées :

- la microscopie confocale permettant de localiser les tannins sans coloration dans la cellule grâce à leur autofluorescence,

- la digestion pariétale permettant de casser spécifiquement le maillage pectique de la paroi et ainsi libérer séquentiellement les tannins.

Ces résultats devraient également nous permettre de mieux comprendre comment les mécanismes de dégradation pelliculaire influencent les mécanismes d’extractibilité et de diffusion des tannins dans les moûts qui impactent directement la perception sensorielle de la

114 composante tannique. En effet, l’association des tannins à des protéines et à des polysaccharides, qui limiterait à la fois leur extractibilité et leur réactivité, permettrait de penser que seuls les tannins libres dans le suc vacuolaire seraient dotés de propriétés gustatives et seraient majoritairement extraits lors de la vinification.

I.

Approche microscopique

Généralement, l’étude de la localisation des composés phénoliques sur des coupes de tissus fixés est réalisée par observations après coloration des tissus au 4-diméthylaminocinnamaldéhyde (DMACA) ou à la vanilline en milieu acide (Li et al., 1996 ; Feucht et al., 2004). Les travaux de Zeiger et Hepler, en 1979, ont mis en évidence l’autofluorescence verte des flavonols, sans traitement chimique et sous excitation en lumière bleue, et ainsi leur localisation dans les vacuoles de cellules d’oignon. Ces travaux ont été récemment confirmés par Sudo et al. (2009) en précisant la localisation de la quercétine, du kaempferol et de la naringenine dans les vacuoles des cellules épidermiques d’oignon. Nous avons choisi d’utiliser cette propriété d’autofluorescence des tannins pour observer leur localisation cellulaire sans coloration des tissus. Mais, avant d’être étudiées en microscopie confocale, les coupes de pellicules ont été observées sous lumière UV ainsi qu’en épi-fluorescence afin de vérifier la présence des tannins.

Cette étude a été menée sur des coupes semi-fines de pellicules de baies de raisin, cépage Cabernet-sauvignon, de la parcelle 3, du millésime 2008. Trois stades ont été étudiés : le stade fermeture de grappe, 80 % véraison et baie mûre correspondant à la récolte.