Le protocole utilisé est celui de Deytieux (2007), adapté de Saravanan et Rose (2004). Les pellicules de 20 baies sont séparées et broyées finement dans l’azote liquide. Pour l’extraction des protéines totales de fleurs, 2 g de fleurs ont été broyés dans l’azote liquide. Trois volumes (p/v) de tampon d’extraction sont ajoutés sur le matériel végétal, dans un tube en téflon pour centrifugeuse. Ce tampon est composé de :
PVPP 1 %
Saccharose 0,7 M
Chlorure de potassium 0,1 M Tampon Tris HCl pH 7,5 0,5 M
98 PMSF dissous dans l’éthanol 1 mM
β mercaptoéthanol 2 %
L’extrait est homogénéisé sur une table d’agitation pendant 30 min dans la glace fondante. Un volume égal d’une solution de phénol (Phe-Tris HCl pH 7,5) est ajouté au mélange. Le tout est bien agité et homogénéisé comme précédemment pendant 30 minutes. L’extrait est centrifugé à 9000 g, pendant 30 min à 4°C et la phase phénolique supérieure est récupérée. La phase aqueuse est extraite de nouveau par ajout de 2 ml de tampon d’extraction et 2 ml de phénol. Ce mélange est agité pendant 15 min puis centrifugé comme précédemment ; la phase phénolique supérieure étant récupérée et ajoutée à la première.
Cette phase phénolique est ensuite lavée trois fois avec un volume égal de tampon d’extraction pour éliminer le maximum d’agents contaminants, tels que les composés phénoliques.
A la phase phénolique sont ajoutés 5 volumes d’une solution d’acétate d’ammonium dans du méthanol à la concentration de 0,1 M. La précipitation des protéines a lieu toute la nuit à – 20°C. Le culot protéique est récupéré après centrifugation à 9000 g pendant 30 min à 4°C et subit plusieurs lavages à l’aide :
1. d’acétate d’ammonium dans le méthanol à 0,1 M 2. de méthanol froid, 2 fois
3. d’acétone 80 % froid, 2 fois.
Entre chaque lavage, le culot dans la solution de lavage est agité au vortex puis soniqué 3 fois 1 min. Les tubes sont ensuite laissés au repos 15 min à – 20°C avant d’être centrifugés 20 min à 9000 g et à 4°C. A la fin des lavages, le culot est finalement séché sous flux d’azote.
99 VII.2.c Western-blot
VII.2.c.i Protocole
Les culots protéiques sont repris dans du tampon Laemmli (Tris-HCl 0,05 M pH 6.8 , SDS 2 %, saccharose 5%, DTT 0,1 M, bleu de bromophénol 0.5 mg.ml-1) et solubilisés 3 min à 100°C. Les échantillons sont ensuite mis à migrer en gel de polyacrylamide 10%.
Les protéines du gel sont transférées sur une membrane de nitrocellulose. Pour cela, une membrane et 4 papiers Whatman 3M sont découpés à la taille de gel et trempés dans le tampon de transfert (Tris 25 mM, Glycine 200mM, méthanol 20%). Le « sandwich » pour le transfert des protéines est composé du côté noir de la cassette, d’un scotch brite, de 2 papiers Whatman, du gel de protéines (d’épaisseur 0,75 mm), de la membrane, de 2 papiers Whatman, d’un scotch brite et du côté rouge de la cassette. La migration est réalisée à 200mA (voltage limitant 100V), pendant 1H30 et à température ambiante.
La membrane est saturée avec la solution de blocage (Lait écrémé 5 %, Tris 10 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, Tween 20 0,1 %) pendant 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4°C. Le tampon de blocage est éliminé puis la membrane est incubée 1 heure avec l’anticorps primaire dilué dans du tampon de blocage avec un volume correspondant à 0,1 ml/cm2 de membrane. La membrane est lavée dans un premier tampon de lavage (Tris 10 mM pH 7,5, NaCl 1 M, Tween 20 0,25 %) pendant 30 min sous agitation et en changeant le tampon toutes les 5 min. Elle subit ensuite deux autres lavages de 5 min dans du tampon Tris 10 mM pH 7,5 avec 1M de NaCl et 0,1 % de Tween 20. La membrane est incubée pendant 1 heure avec les anticorps secondaires commerciaux conjugués à la péroxidase dilués dans du tampon de blocage (volume : 0,1 ml/cm2 de membrane). La membrane est de nouveau lavée dans le premier tampon de lavage pendant 30 min sous agitation en changeant le tampon toutes les 5 min puis dans le second tampon de lavage deux fois 5 min.
La membrane est incubée avec le kit de détection (Opti-4CN Substrate Kit de BIO-RAD) sous agitation pendant 30 min ou jusqu’à ce que le niveau de sensibilité désiré soit atteint. La membrane est ensuite lavée à l’eau bi-distillée pendant 15 min et scannée.
100 VII.2.c.ii Résultats
Afin de confirmer la spécificité des anticorps primaires dirigés contre les protéines PME et PG, des westerns blot ont été réalisés sur des protéines de pellicules de Cabernet-sauvignon au stade récolte (Figure 36). Concernant, la protéine PME, deux bandes ont été détectées à 25 kDa, ce résultat confirme la spécificité de la protéine, les deux autres bandes visualisées sur la membrane pourraient correspondre à une forme de phosphorylation de la protéine. Un western blot sur gel 2D a été réalisé dans le but de confirmer cette hypothèse mais malheureusement les quantités trop faibles de PME n’ont pas permis de la visualiser. Néanmoins, une analyse LC-MS a été entreprise pour confirmer la présence de la protéine. Pour la protéine PG, une bande a été détectée par les anticorps anti-PG, confirmant la spécificité de reconnaissance des anticorps pour la protéine. La taille de la bande observée est supérieure à la taille attendue (47,42 kDa) mais l’étude des séquences blastées avec l’anti-corps anti-PG, n’a pas permis d’infirmer la spécificité. La différence de taille peut provenir d’une modification de conformation de la protéine lui permettant de migrer plus loin dans le gel.
Pour confirmer la spécificité des anticorps contre la protéine ANR, un western blot a été réalisé sur des protéines de fleurs de Cabernet-sauvignon (Figure 37). Deux bandes ont été détectées à 37 kDa, ce résultat confirme la spécificité de la protéine, la deuxième bande visualisée sur la membrane pourrait correspondre à une forme de phosphorylation de la
101 protéine. Un western blot réalisé sur gel 2D a été réalisé dans le but de confirmer cette hypothèse mais malheureusement les quantités trop faibles d’ANR n’ont pas permis de la visualiser.
Pour confirmer la spécificité des anticorps contre la protéine LAR1, un western blot a été réalisé sur des protéines de pellicules de Cabernet-sauvignon au stade fermeture de grappe (Figure 37). Trois bandes ont été détectées à 25 kDa, ce résultat confirme la spécificité de la protéine, les deux autres bandes visualisées sur la membrane pourraient correspondre à une forme de phosphorylation de la protéine. De la même manière que pour l’ANR, un western blot sur gel 2D a été réalisé dans le but de confirmer cette hypothèse mais malheureusement les quantités trop faibles de LAR n’ont pas permis de la visualiser.
De la même manière que pour les anti-corps précédents, l’anti-corps LAR2 a été testé par western-blot (Figure 37). Une seule bande a été détectée à 38 kDa, confirmant la spécificité de l’anti-corps.
102 VII.2.d Analyse LC-MS
VII.2.d.i Protocole
Les spots des protéines d’intérêt sont repérés sur le gel de polyacrylamide 10 %, lavés pendant 4 heures dans un mélange d’eau et d’acétonitrile (ACN) à 50%, (v/v) et digérés selon le protocole décrit par Deytieux et al. (2007).
Les mélanges peptidiques sont analysés par un système HPLC (LC Packings, Amsterdam) couplé à un spectromètre de masse équipé d’une trappe linéaire (LTQ OrbiTrap) (ThermFinnigan, San José, CA).
Les peptides sont séparés sur une colonne C18 PepMap™ de 15 cm et de 75 µm de diamètre interne équipée d’une précolonne C18 PepMap™ de 5mm et 300 µm de diamètre interne.
Le débit de la colonne est de 200 nl/min et les peptides sont élués par un gradient linéaire de 5 à 40 % de solvant B en 35 min (solvant A : 0,1 % d’acide formique, 5 % D’ACN et 95 % d’eau ; solvant B : 0,1 % d’acide formique, 80 % d’ACN et 20 % d’eau). Le spectromètre de masse opère en mode positif avec un voltage appliqué de 2 kV. Les données sont enregistrées en alternant un scan MS sur la gamme m/z 300-1700 et 5 scans MS/MS en mode d’exclusion dynamique, chaque ion étant fragmenté une seule fois.
Les données issues de la fragmentation MS/MS ont été analysées par le logiciel Biowoks (ThermoFinnigan, Torrence, CA) utilisant l’algorythme SEQUEST. La banque interrogée est la banque NCBI de l’espèce Vitis vinifra. L’oxydation des méthionines (+16) et la carbométhylation des cystéines (+57) sont considérées comme modifications différentielles. Seuls les peptides ayant un score de corrélation Xcorr supérieur à 1,9 (peptide monochargé), 2,2 (peptide dichargé), 3,75 (peptide trichargé) et 4 (peptide quadrichargé ou plus) sont retenus. Dans tous les cas, le ∆Cn doit être supérieur à 0,1. Les protéines identifiées sur la base d’un peptide unique sont rejetées.
VII.2.d.ii Résultats
L’analyse des bandes de gel n’a permis d’identifier qu’une seule protéine : la PME. Les séquences peptidiques détectées correspondent à la protéine PME1, Q94B16, notre protéine d’intérêt et une protéine non caractérisée mais identifiée comme une PME, A5AUKI.
103 L’alignement de ces deux protéines montre que leurs séquences diffèrent sur les 45 derniers acides aminés (Figure 38).