16 La PME (EC 3.1.1.11) catalyse l’hydrolyse des groupements méthylesters en C6 des acides galacturoniques présents dans la lamelle moyenne et les parois primaires des végétaux supérieurs (Figure 5). Selon le pH, le degré de méthylestérification initial des pectines, la concentration en ions calcium, l’équilibre hormonal et la présence d’inhibiteurs, la PME peut agir sur les pectines linéairement ou aléatoirement (Micheli, 2001).
Figure 5 : Déméthylation des pectines par la PME.
Plusieurs études ont montré l’appartenance de la PME à une famille multigénique (Richards et al., 1996 ; Micheli et al., 1998) et l’étude du génome d’Arabidopsis thaliana a permis d’identifier près de 67 gènes codant pour la protéine PME (Kaul et al., 2000). Les gènes pme codent pour une pré-pro-protéine possédant une séquence d’adressage pour le réticulum endoplasmique. La pro–région située en N-terminal présente des homologies de séquence avec la protéine inhibitrice des PME, la PMEI. Les isoformes contenant ce domaine ont été classées comme appartenant aux PME de type I tandis que celles de type II en sont exemptes (Micheli, 2001). Les travaux de Bosch, en 2005, ont attribué ce domaine à l’adressage subcellulaire de la protéine mais aussi à une fonction inhibitrice. En effet, la pro-PME est sécrétée dans l’apoplasme via l’appareil de Golgi et la pro-région régulerait la libération des PME matures de l’appareil de Golgi (Wolf et al., 2009), (Figure 6).
Dans la paroi de la cellule, la déméthylestérification linéaire libère des groupements carboxyles qui interagissent avec les ions calcium et créent un gel pectique entraînant une rigidification de la structure. Au contraire, la déméthylestérification aléatoire libère des sites d’action d’endopolygalacturonases qui hydrolysent les chaînes d'acides galacturoniques et contribuent au ramollissement.
Une étude de transgenèse (Vicenzi et al., 2005) a montré que la surexpression d’inhibiteur de PME endogènes chez Arabidopsis thaliana qui empêche la déméthylestérification des pectines, augmentait la résistance à Botrytis cinerea. Les auteurs
17 supposent que l’activité PME favoriserait l’action de polygalacturonases fongiques sur les pectines et concluent que la PME pourrait être impliquée dans la sensibilisation aux pathogènes.
Le transcrit d’un gène pme a été identifié dans la pellicule de Cabernet-sauvignon et ce gène s’exprime de la fermeture de grappe à la maturité avec une augmentation de l’expression à maturité (Deytieux et al., 2008).
L’activité PME a été détectée par différents auteurs dans tous les tissus de la baie : les pellicules de Muscat Gordo Blanco (Nunan et al., 2001) à tous les stades de développement, le péricarpe de l’Ugni blanc (Barnavon et al., 2001), la pulpe et la pellicule de Cabernet-sauvignon (Deytieux, 2005 ; Deytieux et al., 2008). Chez le Cabernet-Cabernet-sauvignon, cette activité
18 chute fortement à la véraison dans les deux tissus, puis augmente à nouveau. A maturité, l’activité PME est maximale dans la pellicule et minimale dans la pulpe.
Son expression tout au long du développement et la diminution constante du degré de méthylestérification des pectines insolubles étayent l’hypothèse de l’implication de la PME dans la maturation de la baie de raisin (Barnavon et al., 2001).
II.3.b La polygalacturonase (PG)
Les polygalacturonases (PG) sont une des familles les plus étudiées dans le ramollissement du fruit lors de la maturation. Les PG sont des glycosidases qui hydrolysent la liaison glycosidique en α-(1→4) entre des résidus d’acide galacturonique non estérifié et notamment dans les chaînes homogalacturoniques.
On distingue deux types d’activités : les exo-polygalacturonases et les endo-polygalaturonases. Les exo-PG ou galacturonan α-1,4-galacturonidases catalysent l’hydrolyse d’acides galacturoniques situés aux extrémités non réductrices des chaînes d’acides galacturoniques, libérant des unités monogalacturonates. Les endo-PG catalysent l’hydrolyse des chaînes d’acides polygalacturoniques et libèrent ainsi de courts fragments d’acides oligo-galacturoniques. L’hydrolyse se produit de façon aléatoire au niveau des liaisons entre les résidus galacturoniques.
Le calcium est un inhibiteur de l’activité polygalacturonase. En effet, in vivo, la liaison du calcium aux pectines pariétales limite l’accès de la PG à son substrat (Buescher et al., 1981 ; Chun et al., 1998) mais la présence d’agent chélateur tel que l’EDTA permet de lever cette inhibition. De plus, in vivo, la pectine méthylestérase (PME) catalyse la rupture de la liaison ester des groupes carboxyles méthylés des résidus galacturoniques. D’après Fisher et Bennet (1991), l’action de la PME serait préalable à celle de la PG en rendant le substrat de cette dernière plus accessible. Ainsi, l’activité PG serait dépendante du degré de méthylestérification des pectines et d’autant plus forte que le degré de méthylation est faible.
L’ensemble des études relatives à la PG semble montrer qu’il existe une famille multigénique de PG chez les plantes. L’arbre phylogénétique, non exhaustif, élaboré à partir
19 des alignements de séquences de gènes codant pour la PG chez 28 espèces végétales est composé de 4 branches (Deytieux et al., 2008).
La première branche, dénommée groupe B, regroupe différentes PG impliquées dans les processus de maturation et de ramollissement des fruits (Wang et al., 2000) ainsi que dans des zones d’abscission et possède un peptide signal qui pourrait jouer un rôle dans le transport cellulaire (Dal Degan et al., 2001). Le gène VvPG1 des baies de raisin appartient à ce premier groupe.
Les gènes VvPG2 et VvPG3 appartiennent au groupe E. Cette branche regroupe un ensemble de gènes dont la spécificité d’expression n’a pas été clairement définie. En effet, de nombreux gènes appartiennent à l’espèce Glycine max et ont été isolés à partir de racines. Ces gènes seraient exprimés en réponse à des attaques d’agents pathogènes (Mahalingam et al., 1999).
Le troisième groupe, PG A, correspond à un ensemble de gènes exprimés dans les fruits climactériques et plus particulièrement chez la tomate selon l’étude de Hadfield et al. (1998).
Le dernier groupe, PG C, regroupe des PG exprimées dans les anthères des fleurs d’Arabidopsis thaliana et de maïs ainsi que dans le pollen de tabac.
Chez le raisin, les résultats des études concernant l’activité de la protéine PG sont très variables. En effet, Cabanne et Donèche (2001) ont montré une activité polygalacturonase croissante au cours de la maturation de la baie du raisin de cépage Sauvignon alors que Nunan
et al. (2001) et Deytieux et al., (2008) n’ont pas détecté d’activité.
Concernant l’expression des gènes pg, Deytieux et al. (2008) ont caractérisé l’expression des transcrits Vvpg1 et Vvpg2 dans la pellicule de baie de raisin du cépage Cabernet-sauvignon. pg1 est temporellement exprimé avec le déclenchement de la véraison alors que pg2 est exprimé uniquement au stade fermeture de grappe et un peu avant la récolte. Leur appartenance à deux groupes distincts souligne que ces deux protéines sont impliquées, si elles sont traduites, dans des mécanismes physiologiques différents : pg1 dans l’expansion pariétale et pg2 dans la signalisation cellulaire grâce à la libération de résidus d’acide polygalacturonique, éliciteurs.
20 Les composés phénoliques ou polyphénols sont largement présents dans le règne végétal (pommes, pêches, thé, cacao, raisins…) et dans les produits qui en dérivent (cidre, thé, chocolat, vins…). Dans la nature, plus de cent mille composés sont présents et près de deux cents sont connus dans le raisin. Dans le vin, les composés phénoliques proviennent principalement de la pellicule et des pépins de la baie de raisin. Les teneurs en tannins des vins rouges varient entre 1 et 4 g.l-1 tandis que dans les vins blancs secs, leur concentration est comprise entre 100 et 300 mg.l-1 (Ribéreau-Gayon et al., 1998). Ces différences sont essentiellement liées à la nature du cépage, au terroir, aux conditions climatiques ainsi qu’aux conditions de vinification.
Au niveau de la plante, ces métabolites secondaires interviennent dans les mécanismes de défense en réponse aux attaques pathogènes. En effet, certains composés amers ou astringents, limitent la palatabilité et la digestibilité de certaines plantes alors que d’autres sont synthétisés de manière accrue avec par exemple des phénomènes de lignification des parois dans le but de limiter la progression des pathogènes. Les tannins par leur complexation avec les polysaccharides pariétaux renforcent la structure des parois cellulaires. Les polyphénols peuvent également, par leur couleur, jouer un rôle dans les mécanismes de pollinisation.
Les polyphénols présentent également des propriétés biologiques intéressantes. Leurs activités anti-oxydantes, anti-cancérigènes, anti-inflammatoires et anti-virales sont largement étudiées en cosmétologie ou pharmacologie.
Enfin, les composés phénoliques jouent un rôle important en œnologie. Les composés de type anthocyanes contribuent à la couleur, alors que les tannins participent aux effets sensoriels tels que l’astringence ou l’amertume. L’étude de ces molécules est donc importante dans différents domaines comme l’oenologie mais aussi en santé humaine (Yadav et al., 2009).
Les polyphénols de la vigne sont répartis en deux groupes : le groupe des flavonoïdes et le groupe des non flavonoïdes.
Les composés flavonoïdes sont formés d’un squelette de base en C15 (C6-C3-C6) correspondant à la structure d’un composé de base appelé 2-phényl-benzopyrane. Le groupe des flavonoïdes, le plus important, comprend :
21 • les anthocyanidines (cyanidine, delphinidine,…) constitutivent des anthocyanes, • les flavanols (catéchine, épicatéchine… dont les polymères constituent les tannins), • les flavonols (kaempférol, quercétol,…).
Le second groupe, les non flavonoïdes, réunit :
• les acides phénols (benzoïques, hydroxycinnamiques), • les stilbènes (resvératrol, picéïde) de structure C6-C2-C6,
• les lignines.
III.1 Les composés non flavonoïdes