2.C Les syst` emes de partition de type

Le syst`eme de partition de type II est tr`es peu r´epandu. Il n’est pr´esent que sur les plasmides et comprend une dizaine de membres (Gerdes et al., 2000). La NTPase est appel´ee ParM et appartient `a la superfamille des actines/hsp70 (heat- shock protein 70). La prot´eine de liaison au centrom`ere est appel´ee ParR et le centrom`ere parC. Comme pour le syst`eme de type Ib, le g`ene parR est situ´e en aval du g`ene parM et le site centrom´erique en amont du locus parMR. Les prot´eines ParM sont compos´ees d’environ 236 `a 336 r´esidus, alors que les prot´eines ParR, plus petites, sont compos´ees d’environ 46 `a 120 r´esidus. Les prot´eines ParR agissent comme autor´egulateurs transcriptionnels tout comme les prot´eines ParB du type Ib et les prot´eines ParM ne montrent pas d’activit´e de liaison `a l’ADN.

2.C.1

Le syst`eme

parMRC du plasmide R1

Le syst`eme de partition de type II le plus ´etudi´e est celui du plasmide R1 d’E coli (Figure 7). La NTPase ParM est une prot´eine de 37,5 KDa capable de fixer l’ATP et le GTP (Jensen and Gerdes, 1997; Popp et al., 2008). La prot´eine de liaison au centrom`ere ParR est une prot´eine de 13,3 KDa capable de fixer sp´ecifiquement le centrom`ere de R1 parC, constitu´e de deux clusters de cinq r´ep´etitions de 11pb, qui sont localis´es de chaque cˆot´e du promoteur de l’op´eron (Bre¨uner et al., 1996; Dam and Gerdes, 1994). Les 10 r´ep´etitions sont requises pour une partition efficace.

2.C.2

Structure des complexes ParR-centrom`ere

Le plasmide pB171 d’E. coli a la particularit´e de poss´eder deux syst`emes de partition, par1 de type II et par2 de type I (Ebersbach and Gerdes, 2001). Comme pour le plasmide R1 la prot´eine ParR se fixe au centrom`ere du locus de type II port´e par ce plasmide. La structure des r´esidus 6 `a 95 de ParR a ´et´e r´esolue (Moller- Jensen et al.,2007)(Figure 17A). Les structures des trente-cinq r´esidus en C-terminal et des r´esidus 1 `a 5 n’ont pas ´et´e r´esolues. La structure contient deux monom`eres formant une unit´e asym´etrique, o`u chaque monom`ere est compos´e d’un brin β en N-terminal suivi de cinq h´elices α. La r´egion de dim´erisation en N-terminale forme une structure RHH2, compos´ee d’un feuillet β antiparall`ele accompagn´e de deux h´elices α de chaque monom`ere. La prot´eine ParG cod´ee par le locus de partition de type Ib du plasmide TP228 fait aussi partie de cette famille (Golovanov et al.,

2003). La caract´eristique des prot´eines `a motif RHH2 est la nature coop´erative de leur liaison `a l’ADN. Dans le cristal, ParR de pB171 est assembl´ee en une structure h´elico¨ıdale continue de 12 paires de dim`eres de ParR formant un tour complet de 360˚et de 15nm de diam`etre. Les dim`eres de ParR sont positionn´es de sorte que

A B

C D

Figure 18 – Structure de ParM et des filaments de ParM

A-B) Repr´esentation du diagramme d’un dim`ere ParM sous forme libre (A) ou sous forme complex´e `a l’ADP (B). C) A gauche, image d’un filament de ParM en ME et `a droite reconstruction tridimensionnelle d’un filament de ParM. D) A gauche reconstruction tridimensionnelle d’un filament de ParM (Orlova et al., 2007) avec en transparence cinq sous-unit´es de ParM. La fl`eche repr´esente l’enroulement gauche du filament. A droite, reconstruction tridimensionnelle d’un filament de ParM (Popp et al., 2008) (Extrait de Orlova et al. 2007; Popp et al. 2008; Van Den Ent et al. 2002.)

leur r´egion N-terminale est orient´ee vers l’ext´erieur de la structure et leur r´egion C-terminale vers l’int´erieur. Les domaines de reconnaissance de l’ADN sont donc orient´es vers l’ext´erieur de l’h´elice ParR, ce qui permet `a l’ADN de s’enrouler au- tour. Des ´etudes sur la fixation de ParR de R1 sur son site parC en microscopie ´electronique (Moller-Jensen et al., 2007) ont confirm´e que le complexe de partition de ParR-parC forme une structure en anneaux de 15 `a 20 nm de diam`etre. Les auteurs ont sugg´er´e que les images de microscopie ´electronique ne sont pas des an- neaux, mais probablement des projections de la nature h´elico¨ıdale des arcs observ´es pour ParR de pB171.

La cristallisation du complexe ParR-centrom`ere de type II du plasmide pSK41 a permis de pr´eciser la structure de ces complexes (Schumacher et al., 2007). Elle montre que comme pour ParR de pB171, ParR de pSK41 contient un motif RHH2 grˆace `a la dim´erisation de son domaine N-terminal (Figure 17B). Des analyses de retard sur gel et de protection de l’ADN par empreinte `a la DNAseI montrent que ParR du plasmide R1 fixe de mani`ere coop´erative les dix r´ep´etitions directes de parC en formant un grand complexe nucl´eoprot´eique qui inclue ´egalement la r´egion pro- motrice localis´ee entre les deux clusters (Moller-Jensen et al., 2003). Par la nature coop´erative des ParR fix´es, les dim`eres de prot´eines li´es `a l’ADN forment des inter- actions ´etroites qui conduisent `a la cr´eation d’une superstructure prot´eique continue distinguant ainsi les surfaces ´electrostatiques positives ou n´egatives (Figure 17C). Cette superstructure de 18 nm de diam`etre est de nature h´elico¨ıdale et confirme les hypoth`eses ´emises sur les complexes ParR-centrom`ere de R1 et de pB171.

Ces donn´ees indiquent une conservation dans l’assemblage des complexes de par- tition de type II et sugg`erent donc que cette structure nucl´eoprot´eique est importante pour le processus de partition.

2.C.3

Structures des prot´eines et filaments de ParM

Les structures de ParM de R1 sous forme libre ou complex´ee avec l’ADP (Van Den Ent et al.,2002) confirment que ParM poss`ede bien un repliement caract´eristique des prot´eines de la famille des actines : deux domaines appel´es I et II respectivement divis´es en deux sous-domaines A et B (Figure 18A-B). En g´en´eral, chez les actines, les deux petits sous-domaines (IB et IIB) sont tr`es variables en taille et en structure alors que les deux grands sous-domaines partagent un repliement commun compos´e de cinq brins β surenroul´es par trois h´elices α. La comparaison des deux structures de ParM (ParM libre/ParM-ADP) montre que la fixation `a l’ADP induit une fer- meture des deux domaines (I et II) qui subissent une rotation de 25˚. En pr´esence de GDP, les structures obtenues pr´esentent les mˆemes conformations (Popp et al.,

Figure 19 – Mod`ele de la polym´erisation de ParM en marche d’escalier L’h´elice de ParR, fix´ee `a parC, reconnaˆıt les sous-unit´es ParM-ATP. Une seule sous- unit´e ParM-ATP s’ajoute sur un des deux protofilaments (1). L’hydrolyse de l’ATP (2) cr´ee une translocation processive de l’h´elice ParR (3). Une nouvelle sous-unit´e de ParM-ATP s’ins´ere sur l’autre protofilament et engage un deuxi`eme cycle (4). (D’apr`es Salje and L¨owe 2008.)

Figure 20 – Mod`ele de la partition du plasmide R1

A : la nucl´eation de nouveaux filaments de ParM est initi´ee au complexe ParR-parC. Le filament attach´e recherche un second complexe de partition. B : les plasmides diffusent dans la cellule jusqu’`a ˆetre suffisamment proches pour se rencontrer. C : Les filaments fixent un plasmide `a chacune de leur extr´emit´e, formant un fuseau. Les fila- ments sont alors stabilis´es. D : Ces filaments continuent `a polym´eriser, poussant les plasmides aux pˆoles de la cellule. E : Apr`es l’arriv´ee aux pˆoles, le filament est dissoci´e du plasmide et d´epolym´erise rapidement. (Extrait deCampbell and Mullins 2007.)

Des ´etudes r´ecentes montrent que les filaments de ParM ont une fonction directe dans la s´egr´egation des plasmides (Campbell and Mullins,2007;Garner et al.,2004;

Popp et al., 2008). Initialement, la visualisation des filaments de ParM, provient d’observation microscopique par immunofluorescence. ParM forme des polym`eres dynamiques qui s’´etendent le long des cellules d’E. coli (Moller-Jensen et al.,2002) et ces polym`eres se forment aussi in vitro en pr´esence d’ATP ou de GTP (Moller-Jensen et al., 2002; Popp et al., 2008). En microscopie ´electronique (ME), ces polym`eres sont observ´es sous forme de filaments ordonn´es (Figure 18C). In vivo et in vitro les filaments de ParM pr´esentent une forte instabilit´e dynamique et sont stabilis´es si chaque bout du filament est associ´e au complexe de partition ParR-parC (Camp- bell and Mullins, 2007; Garner et al., 2004). Des analyses en ME montrent qu’un seul et unique filament de ParM peut pr´esenter `a ces deux extr´emit´es un complexe ParR-parC (Choi et al., 2008; Salje and L¨owe, 2008). La croissance des filaments est possible grˆace `a l’incorporation de mol´ecules de ParM-ATP suppl´ementaires au niveau des complexes ParR-parC (Garner et al.,2004). Le filament croˆıt de mani`ere bidirectionnelle et poussent les plasmides aux pˆoles des cellules, puis il d´epolym´erise rapidement. Sur des cryosections de cellules, ces filaments sont visualis´es en fa- got, toujours orient´es suivant l’axe de la cellule et localis´es autour du nucl´eo¨ıde (Salje et al., 2009). De mani`ere remarquable, ce syst`eme a ´et´e reconstitu´e in vitro simplement avec ces trois composants et de l’ATP. Dans ces conditions, des billes magn´etiques complex´ees avec des sites parC, sont pouss´ees en pr´esence des prot´eines purifi´ees ParR et ParM `a une vitesse comparable `a celle observ´ee lors de la s´eparation des plasmides R1 dans la cellule (Campbell and Mullins,2007; Garner et al., 2007). Ceci indique que ce syst`eme parRMC est suffisant `a la partition et ne n´ecessite pas l’intervention de facteurs de l’hˆote. Deux mod`eles des filaments de ParM ont ´et´e reconstitu´es grˆace aux donn´ees de ME et de cryo-ME (Orlova et al., 2007; Popp et al., 2008) (Figure 18D). Dans ces deux mod`eles, les filaments de ParM sont si- milaires sur leur forme et leur dimension, mais contrairement aux filaments d’actine qui ont un pas d’h´elice droit, les filaments de ParM ont un pas d’h´elice gauche. Les extr´emit´es sont compos´ees de monom`eres de ParM-ATP (ou GTP) alors que le filament est compos´e de ParM-ADP (ou GDP) (Popp et al., 2008; Van Den Ent et al.,2002). Salje et L¨owe ont propos´e un mod`ele enmarche d’escalier, bas´e sur l’ajout s´equentiel de monom`eres de ParM-ATP sur chaque protofilament, entraˆınant le d´eplacement successif du complexe ParR-parC (Figure 19).

Ces ´etudes ont permis d’´emettre pour le syst`eme de partition de type II, le mod`ele de la polym´erisation insertionnelle d’actine, lepushing, dans lequel les filaments de ParM s’ins`erent entre les deux plasmides pour les propulser aux pˆoles des cellules (Figure 20). Selon ce mod`ele, apr`es la formation du complexe de partition, les plas-

Figure 21 – Appariement de plasmides R1

(A-E) Observation en ME des complexes de partition form´es sur les plasmides R1 et de l’appariement sp´ecifique de deux mol´ecules d’ADN au niveau du complexe de partition (C-E). La barre correspond `a un kb. (Extrait de Jensen et al. 1998.)

mides seraient appari´es. Cet appariement des plasmides R1 aux sites centrom´eriques parC a ´et´e observ´ee directement par ME (Figure 21) (Jensen et al., 1998). L’insta- bilit´e dynamique du filament pourrait ˆetre un contrˆole permettant de pr´evenir les ´ev`enements pr´ecoces de polym´erisation. Pour se stabiliser, chaque bout du filament doit ˆetre attach´e `a un complexe de partition. Le filament de ParM se formerait donc entre les complexes appari´es, prˆets `a ˆetre s´epar´es, et s’´etendrait en d´epla¸cant ainsi les plasmides `a chaque pˆole de la cellule.