Au cours de cette ´etude, nous nous sommes heurt´es `a une difficult´e. Il semblerait que les polym`eres soient instables in vitro. Nous avons essay´e plusieurs conditions pour stabiliser les polym`eres, mais seule la multiplication des ´echantillons nous a permis d’avoir quelques observations exploitables. De ce fait, `a cause de la non reproductibilit´e de ces donn´ees, mes r´esultats restent pr´eliminaires. Ces r´esultats sont repr´esent´es sur la figure 33. La polym´erisation de SopA est inhib´ee en fonction de la concentration d’ADN, mais en pr´esence de SopB et d’ADN, la polym´erisation de SopA n’est pas affect´ee (Bouet et al.,2007). Dans nos conditions, la pr´esence du complexe de partition n’est donc pas inhibitrice de la polym´erisation de SopA. Dans les exp´eriences suivantes, nous avons ajout´e le complexe de partition en incubant SopB avec la s´equence compl`ete du site centrom´erique sopC port´ee par un plasmide (pZC204). Dans ces conditions, les filaments observ´es en contact avec l’ADN sont structur´es diff´eremment (Figure 33a-g). Ils sont organis´es en fibres droites de 20 `a 40 nm d’´epaisseur et peuvent atteindre des longueurs comprises entre 0,1 et 2 µm. Dans certains cas, des mol´ecules d’ADN sont en contact avec le filament, et sont positionn´ees al´eatoirement tout au long du filament. La zone de contact avec le filament peut ˆetre ´etendu (Figure 33d,e,g) ou limit´ee sur une petite r´egion de l’ADN (Figure 33a,b,c,f). Parfois, deux mol´ecules d’ADN sont retrouv´ees `a des positions ´eloign´ees d’un mˆeme filament (Figure 33a,d). Les filaments ne sont pas observ´es en absence d’ATP, comme d´ecrit pr´ec´edemment (Bouet et al.,2007). Cette structure en forme de fibre adopt´ee par les polym`eres de SopA peut ˆetre conditionn´ee par SopB et l’ADN et donc d´ependant de la pr´esence du complexe de partition. Pour v´erifier cette hypoth`ese, nous avons recherch´e si SopA seule formait aussi des structures similaires.
1.B.2
Les fibres de SopA en absence du complexe de parti-
tion
En absence du complexe de partition, SopA forme ´egalement des fibres droites ou tress´ees entre elles donnant ainsi une forme spiral´ee aux filaments (Figure 34a-g). Ces fibres semblent d’une texture plus souple si on les compare aux fibres observ´ees avec le complexe de partition. Elles atteignent des longueurs comprises entre 0,1 et 2 microm`etres et leurs ´epaisseurs sont d’environs de 15, 30 ou 65 nm. Ce qui sugg`ere que si une fibre unique mesure 15 nm d’´epaisseur, les fibres de 30 et de 65 nm d’´epaisseur peuvent ˆetre respectivement compos´ees de 2 et de 4 fibres uniques. Ces r´esultats sont aussi consid´er´es comme pr´eliminaires, car les exp´eriences sont
Figure 34 – Observation des filaments de SopA en pr´esence d’ATP en microscopie ´electronique
SopA (2 µM) est incub´ee en pr´esence d’ATP (1 mM). L’´echelle est repr´esent´ee sur chaque figure.
peu reproductibles `a cause de l’instabilit´e des filaments.
1.B.3
Discussion
Les filaments de SopA en forme de fibre que nous avons pu observ´ees au cours de cette ´etude sont diff´erents des paquets de filaments caract´eris´es initialement. Il est possible que ces deux types de filaments existent in vitro. En effet, des formes de filaments diff´erentes de celles observ´ees pour SopA ont aussi ´et´e observ´ees pour ParA de pB171 et pour ParA de P1 (Dunham et al., 2009; Ebersbach et al., 2006). Il a ´et´e montr´e que la prot´eine MinD un ATPase de la famille des Walker Box forme deux types de filaments in vitro : des filaments en forme de paquets comme pour SopA et ParF (Suefuji et al., 2002) ou des filaments en forme de tubes (Hu et al., 2002). Les paquets de filaments initialement observ´es pour SopA, pourraient ˆetre un ´etat transitoire des filaments en forme de fibres. La polym´erisation de SopA pourrait n´ecessiter un assemblage en plusieurs ´etats avant d’atteindre une structure rigide capable de s´eparer les mol´ecules d’ADN. De plus certaines fibres tress´ees de la figure 34 semblent ˆetre compos´ees de plusieurs petites fibres, ce qui soutiendrait l’hypoth`ese de l’assemblage des polym`eres.
Les filaments observ´es en pr´esence du complexe de partition paraissent plus rigides que ceux observ´es en absence du complexe de partition. Pour le syst`eme de partition du plasmide pTP228, il apparaˆıt que ParG influence la polym´erisation de ParF in vitro (Barill`a et al.,2005). A faible rapport ParG/ParF, ParG agit comme un facteur stabilisant et permet la formation de filaments plus longs et plus ´epais qu’en absence de ParG. Pour le syst`eme de partition du chromosome deux de V. cholerae, la structure du filament de ParA2 est aussi influenc´ee par la pr´esence d’un facteur nucl´eotidique (Hui et al., 2010). En effet, ParA2 polym´erise sur l’ADN en pr´esence soit de l’ATP, soit de l’ADP ou en absence de nucl´eotide. Cependant, seul l’ATP permet une structure des filaments plus r´eguli`ere et plus ´epaisse. Il est possible que SopB ou SopB fix´ee `a sopC puisse influencer la structure des polym`eres en donnant `a SopA une conformation diff´erente de sa conformation adopt´ee en absence de ces deux protagonistes. Ce changement de conformation pourrait ˆetre une ´etape de contrˆole de la partition, permettant ainsi de promouvoir la s´eparation des plasmides juste au moment o`u le substrat de la partition serait prˆet `a ˆetre s´egr´eg´e apr`es la formation du complexe de partition.
Dans certains cas, nous avons observ´e que la zone de contact entre l’ADN et le filament de SopA peut s’´etendre sur une grande r´egion (Figure 33d,e,g). L’ADN in- hibe la formation des polym`eres et SopB par son activit´e de fixation `a l’ADN permet la polym´erisation de SopA en masquant l’ADN. En admettant que nos observations sont confirm´ees, ces donn´ees sugg`erent que le filament de SopA contacteraient
Figure 35 – Observation des filaments de SopA-D145A en pr´esence du complexe de partition en microscopie ´electronique
SopA (2 µM) est incub´ee en pr´esence de SopB (1µM) et de sopC (pJYB57 1 nM) en pr´esence d’ATP (50 µM). Les fl`eches indiquent la zone de contact entre l’ADN et les filaments. L’´echelle est repr´esent´ee sur chaque figure.
l’ADN par l’interm´ediaire de SopB fix´ee `a l’ADN. La grande r´egion de contact avec l’ADN observ´ee ici, pourrait repr´esenter un complexe de partition ´etendu grˆace `a l’´etalement de SopB sur l’ADN. Cette fonction de SopB permettrait non seule- ment la polym´erisation de SopA, mais aussi augmenterait les chances de capture des mol´ecules d’ADN par le filament. On peut imaginer que l’´elongation du fila- ment s´eparerait les mol´ecules d’ADN. Des exp´eriences en pr´esence d’un plasmide ne poss´edant pas sopC devront ˆetre r´ealis´ees pour confirmer ces r´esultats.
Le principal probl`eme rencontr´e au cours de cette ´etude est la reproductibilit´e des exp´eriences. Pour confirmer ces r´esultats pr´eliminaires, nous devons trouver des conditions pour stabiliser les filaments observ´es. Une alternative serait d’utiliser un traceur mol´eculaire comme par exemple des anticorps coupl´es `a des billes d’or fa- cilement rep´erables en ME. Cette technique nous permettrait de confirmer grˆace `a des anticorps reconnaissant sp´ecifiquement SopA, si l’objet observ´e est compos´e de SopA. Une autre alternative consiste `a utiliser un mutant de SopA (SopA-D145A) capable de polym´eriser, mais incapable d’hydrolyser l’ATP (Castaing, Lane, Bouet donn´ees non publi´ees). En effet, nous pensons qu’in vivo l’hydrolyse de l’ATP pour- rait d´estabiliser les filaments et que d’apr`es les propri´et´es de cette prot´eine mutante, les filaments pourraient ˆetre stabilis´es.
Cependant pour la coloration n´egative n´ecessaire pour les observations en ME, on utilise de l’ac´etate d’uranyle, un contrastant `a pH acide. Ce contrastant peut ˆetre aussi la cause de l’instabilit´e des filaments observ´ee in vivo. N´eanmoins les premi`eres observations r´ealis´ees avec ce mutant en pr´esence du complexe de partition nous ont permis de mettre en ´evidence des fibres similaires aux fibres observ´ees pour SopA (Figure 35). Ces fibres plus petites, de 100 `a 200 nm de longueur, sont aussi en contact avec l’ADN. Cependant d’autres observations sont n´ecessaires pour confir- mer ce r´esultat. La derni`ere alternative pour stabiliser les filaments, est l’´etude des filaments en cryo-microscopie. Cette technique a l’avantage de congeler l’´echantillon dans un milieu soluble et de faire des observations tout en gardant l’´echantillon congel´e.
A ce jour, le rˆole des polym`eres des syst`emes de partition de type I reste encore inconnu. Leur fonction pourrait ˆetre essentielle pour la partition. Une hypoth`ese est que ces polym`eres seraient `a l’origine de la s´eparation des plasmides comme pour le syst`eme de partition de type II o`u ParM forme un filament qui pousse les plasmides `a chaque pˆole de la cellule. In vivo, SopA pourrait avoir le mˆeme comportement, c’est pourquoi, la caract´erisation des filaments en pr´esence du complexe de parti- tion sera une ´etape importante pour la compr´ehension du m´ecanisme de partition plasmidique.