utilisant les propriétés gélifiantes de l'alginate, phase continue pour le mélange de composition 1,5 % (m/m) d'alginate / 4 % (m/m) de caséinate. Dans la littérature, deux méthodes de gélification sont citées :
• (i) Méthode « externe » ou dialyse : diffusion passive d’ions bivalents gélifiant (notre cas) ;
• (ii) Méthode « interne » : libération in situ d’ions bivalents gélifiant Ca2+ (introduits sous
forme de sel peu soluble) par gradient de pH obtenu par acidification progressive en utilisant la glucono-δ-lactone (GDL) par exemple.
4.3.2.1 Réseau d'alginate et gel mixte
La planche d'images de la Figure 4.14 présente les microstructures observées en
microscopie confocale et en microscopie électronique à balayage des billes d'alginate et d'alginate/caséinate. Les échantillons observés ont été préparés à partir de billes venant d'être gélifiées. Sur ces échantillons, il n'y a donc pas eu de suivi cinétique.
A. Bille Alginate 1,5 – MRS 20
A.1 MCBL A.2 MEB
B. Bille alginate 1,5 – caséinate 4 – MRS 20
B.1 MCBL(caséinate marquée à la RITC) B.2 MEB
Figure 4.14 Observations microscopiques des billes d'alginate et d'alginate/caséinate (composition donnée en % (m/m)). MCBL, coupe de 10 µm après fixation au paraformaldéhyde et congélation dans l'isopentane : A.1, B.1.
MEB, bille déshydratée par la méthode du point critique : A.2, B.2. et → : microdomaines de protéine.
(Lee et al., 2011). Cette organisation particulière des chaînes polyosidiques donne ce réseau typique visible sur nos images. Les ions Ca2+ permettent la jonction entre les zones GG des chaînes polyosides d'alginate. Un réseau tridimensionnel se forme par agrégation de plusieurs chaînes d'alginate.
D'après les images A. de la Figure 4.14, le réseau d'alginate est poreux et sa densité varie en
fonction de la zone dans la bille. Auparavant, d'autres auteurs ont observé ce même type de structure. La méthode dite externe ou dialyse donnerait des systèmes plus hétérogènes que la
méthode interne (Stoppel et al., 2011). Généralement, le gel est plus dense (réseau serré) sur le bord
de la bille et plus ouvert et poreux au centre de la bille (Thu et al., 2000 ; Wright et al., 2009). Cet
effet a également été retrouvé sur nos clichés. Une membrane épaisse et solide a été mise en
évidence, l’intérieur des billes quant à lui présente de nombreux pores (Figure 4.14 images A.1).
Cette hétérogénéité peut être expliquée par un mécanisme de gélification rapide et quasi-irréversible, caractérisé par un site de liaison à forte réticulation des ions, et une vitesse de diffusion relative entre les ions calcium et les molécules de polymère insuffisante par rapport à la vitesse du
mécanisme de gélification (Thu et al., 1996). Néanmoins, l’augmentation de la concentration en
ions calcium permet d’obtenir des billes moins hétérogènes. Thu et al., en 2000, ont réalisé des
images en résonance magnétique (IRM) de billes d'alginate (de 2,3 mm de diamètre à 1,8 % (m/v)
d'alginate riche en unités G) gélifiées avec 50 et 100 mmol.L-1 de CaCl2 pour étudier la répartition
de la concentration en polymère. Les billes gélifiées avec une concentration en CaCl2 de 100
mmol.L-1 (concentration utilisée dans notre étude) ont montré une meilleure homogénéité.
L'hétérogénéité de ce gel peut également être expliquée par la teneur en unités G et la longueur des
blocs GG déterminée précédemment par l'analyse RMN1H. L'alginate utilisé est principalement
composé d'unités M (75 %), de structure en blocs avec des blocs d'unités G composés d'environ 7 monomères. Selon Gombotz et Wee, en 2012, pour obtenir des billes avec des propriétés mécaniques fortes, une meilleure stabilité vis-à-vis des cations, l'alginate doit être composé de plus de 70 % d'unités G et la longueur moyenne de ses blocs GG doit être de plus de 15 unités. Un gel réalisé à partir d'un alginate pauvre en G sera plus déformable et moins rigide. Même si d'un point de vue structurel, ce gel fragile obtenu peut être un inconvénient, pour la diffusion (1) des métabolites de la bille vers les cellules, (2) des actifs antimicrobiens des cellules productrices vers l'extérieur de la bille, la structure de ce réseau poreux pourrait s'avérer être un avantage.
Concernant les billes d'alginate/caséinate, le réseau d'alginate et celui de caséinate semblent enchevêtrés sur les observations en microscopie confocale et sont difficilement identifiables par le
des flèches Figure 4.14 image B.1). Dans un premier temps, deux hypothèses peuvent être proposées : (i) soit ces zones seraient plus concentrées en protéine, (ii) soit cette fluorescence serait due au relief de la coupe. Les observations en MEB ont permis de valider la première hypothèse (i).
En effet, sur les images B.2 (Figure 4.14), des zones plus claires riches en protéines (comme des
inclusions) dans le réseau d'alginate typique peuvent être distinguées (zones cerclées sur les images B.2 Figure 4.14). La gélification aurait donc permis de fixer l'état de séparation de phase instantanément. Aucun travail n'a été publié sur l'étude de microstructure de billes gélifiées réalisées à partir d'un mélange polymérique aqueux biphasique permettant la comparaison avec nos résultats.
Les cellules de Lactococcus lactis LAB3 ont été incorporées dans les mélanges
polymériques avant la gélification. De la même façon que précédemment, la localisation de ces cellules a été étudiée en fixant les billes dès l'état initial. Sur ces échantillons, il n'y a donc pas eu de suivi cinétique.
4.3.2.2 Localisation des cellules dans les systèmes polymériques gélifiés (sous forme de billes)
Deux séries d'expérimentation ont été menées avec une charge bactérienne initiale
différente : C1, 105-6 UFC/bille et C3, 107-8 UFC/bille. La charge C3 a été utilisée pour visualiser les
cellules de façon optimale. Pour les observations en microscopie confocale, les cellules de bactéries lactiques et la phase protéique ont été marquées, respectivement, en utilisant le fluorochrome
Syto®9 et la RITC. Les images des billes d'alginate et d'alginate/caséinate avec les cellules de
I. Bille Alginate 1,5 – MRS 20 – LAB3 C1
I.1 Image en gris (MCBL) I.2 LAB3-Syto®9 (MCBL)
I.3 Intérieur (MEB) II. Bille alginate 1,5 – caséinate 4 – MRS 20 – LAB3 C1
II.1 Image en gris
II.2Marquage LAB3-Syto®9 II.3 Intérieur
Figure 4.15 Observations microscopiques des billes d'alginate et d'alginate/caséinate (composition donnée en % (m/m)) en présence de cellules de LAB3 incorporées à C1
(105-6 UFC/bille).
MCBL, coupe de 10 µm après fixation au paraformaldéhyde et congélation dans l'isopentane : I.1, I.2, II.1, II.2. MEB, bille déshydratée par la méthode du point critique : I.3, II.3.