Pour observer la répartition des cellules bactériennes dans les systèmes de confinement, la microscopie est l'outil le plus utilisé. Les systèmes biologiques sont généralement tridimensionnels : les systèmes polymériques biphasiques envisagés dans cette étude en font partie. Avec un microscope conventionnel, la lumière de toutes les zones de l'objet, pas seulement de la zone de mise au point, entre dans le microscope et est utilisée pour créer une image brouillée et confuse. Grâce au développement du Microscope Confocal à Balayage Laser (MCBL), ce problème a été résolu. Le microscope confocal permet une meilleure résolution axiale grâce à la présence d'un trou de filtrage (pinhole, diaphragme) adapté qui permet d'éliminer la lumière émise par les plans sous- et sur-jacents au plan de focalisation. Son utilisation est souvent couplée à l'emploi de fluorochromes.
1.2.5.1 Systèmes polymériques biphasiques et microscopie confocale
Les chercheurs spécialistes des mélanges d'hydrocolloïdes utilisent généralement la microscopie confocale pour déterminer le comportement de déphasage d'un mélange. Pour différencier la phase protéique de la phase polyosidique, la protéine est le plus souvent marquée
avec la Rhodamine B IsoThioCyanate (RITC) (Alves et al., 2001 ; Butler et Heppenstall-Butler,
2003 ; Nono et al., 2011 ; Mession et al., 2012 ; Perrechil et Cunha, 2012). La RITC est connue
pour se lier aux protéines par des liaisons hydrophobes. Des faibles quantités de l'ordre de 10 ppm
suffisent (Mession et al., 2012).
Figure 1.14 Images de microscopie confocale de mélanges caséinate de sodium
(SC) / κ-carraghénane (KC) dans NaCl à 0,1 mol.L-1 (Nono et al., 2011).
La concentration de chaque polymère est indiquée en g.L-1. Les échantillons ont été mélangés et chauffés 5 min à 60°C puis observés immédiatement à 20°C. Les zones claires sont les zones riches en protéines. Le format des images est de 160 x 160 µm.
1.2.5.2 Les fluorochromes pour marquer les cellules bactériennes
Différents fluorochromes sont généralement utilisés comme marqueurs pour l'observation par microscopie de fluorescence des microorganismes. Pour marquer les acides nucléiques et étudier l'intégrité cellulaire, les principaux cités sont : l'iodure de propidium (IP), le DAPI (4', 6'-diamino-2-phénylindole), l'acridine orange et le Syto 9. Leurs caractéristiques sont présentées
dans le Tableau 1.15 (Breeuwer et Abee, 2000 ; Joux et Lebaron, 2000). Certaines colorations
permettent de détecter la totalité de la population, d'autres uniquement les cellules mortes et d'autres uniquement les cellules vivantes.
Tableau 1.15 Caractéristiques des fluorochromes les plus couramment utilisés pour marquer les acides nucléiques et étudier l'intégrité cellulaire.
Fluorochromes λ d'excitation
(nm) λ d'émission (nm) Cible Mode d'action
Iodure de propidium 535 617 ADN -Pénètre les cellules ayant une
membrane endommagée : fixation aux acides nucléiques
-Fluorescence rouge DAPI
(4', 6'-diamino-2-phénylindole) 345 455 ADN/ARN -S'intercale entre les bases A, T, U en émettant une fluorescence bleue
Acridine orange 503 530/640 ADN/ARN -Si le rapport ARN/ADN est élevé, les
bactéries sont actives → coloration rouge ou orange
-Si le rapport ARN/ADN est faible, les bactéries sont mortes → coloration verte
Syto 9 504 523 ADN -Pénètre dans les cellules quelque soit
leur état physiologique et se fixe aux acides nucléiques
-Fluorescence verte des cellules
Depuis une dizaine d'années, le kit Live/Dead® BaclightTM (Molecular Probes, Oregon,
États-Unis) est de plus en plus utilisé en recherche dans divers domaines et notamment l'analyse de
la viabilité de microorganismes encapsulés (Pereira et al., 2005 ; Wadhawan et al., 2011). La
coloration avec le kit Live/Dead® BaclightTM Bacterial Viability Kit peut être utilisée pour
simplement localiser les cellules mais elle permet également d'estimer la population de bactéries viables et de bactéries totales d'un échantillon.
Ce kit est composé de deux fluorochromes cités précédemment : le Syto 9 et l'iodure de propidium (IP). Ce sont des marqueurs des acides nucléiques mais ils diffèrent par leurs caractéristiques spectrales et leur capacité à pénétrer dans la cellules. Le Syto 9 est un fluorochrome perméant qui est capable de pénétrer toutes les cellules quel que soit leur état physiologique puis de se fixer aux acides nucléiques et de colorer les cellules en vert. Ainsi, ce fluorochrome peut être utilisé pour le marquage et le dénombrement de la totalité des cellules présentes dans un échantillon donné. L'IP est utilisé comme contre colorant du Syto 9 permettant de distinguer les cellules mortes des cellules viables. Il est non perméant du fait de la taille et de la charge de la molécule de propidium et pénètre exclusivement les bactéries dont la membrane cytoplasmique est endommagée pour se fixer aux acides nucléiques et colorer ainsi les cellules en rouge.
a b
Figure 1.15a. Mode de fonctionnement des deux fluorochromes du kit Live/Dead® BaclightTM
b. Viabilité d'une culture de Lactococcus lactis LAB3 (starter commercial MD089,
Ezal line, Rhône Poulenc, Dangé Saint-Romain, France) dans MRS en anaérobiose à
24 h en utilisant le kit Live/Dead® BaclightTM, objectif 100, microscope à
épifluorescence Axiovert25 (Zeiss).
L'intensité de la fluorescence obtenue avec ces deux fluorochromes est grande, avec un contraste important entre les cellules vertes et les cellules rouges, et une fluorescence de fond minimale
(Boulos et al., 1999).
Dans la littérature, le kit Live/Dead® BaclightTM a été utilisé dans les deux cas auxquels nous nous
sommes intéressés dans cette étude : (i) mélanges dispersés (type émulsion) et (ii) gels
d'immobilisation des cellules.
(i) Pour ce premier cas, les travaux exposés dans la littérature sont le plus souvent en rapport avec
les matrices alimentaires. Par exemple, Auty et al., 2001, ont incorporé des souches probiotiques
dans du lait écrémé et du fromage de type Cheddar. Même dans ces milieux complexes, le
a b
Figure 1.16 Exemples de marquage cellulaire par le kit Live/Dead® BaclightTM dans des systèmes
dispersés complexes (d'après Auty et al., 2001; Shima et al., 2006)
a. Observation de la souche probiotique Bifidobacterium sp. UCC 35612 marquée avec le kit Live/Dead® BaclightTM
dans du fromage type Cheddar (échelle 25 µm) (Auty et al., 2001).
Les cellules sont observées dans la phase protéique verte claire. Les espaces noirs représentent les matières grasses. b. Cellules de Lactobacillus acidophilus JCM1132 (souche probiotique) incorporées dans une émulsion eau dans huile dans eau pour un effet de protection. Cette photographie est composée de l'image optique et de l'image avec le filtre de fluorescence du Syto 9 uniquement (Shima et al., 2006).
Les flèches pointent les cellules contenues dans les gouttelettes d'huile.
(ii) L'immobilisation de cellules est largement utilisée dans la plupart des applications en
biotechnologies et là encore, le kit Live/Dead® BaclightTM a été mis en œuvre. Wadhawan et al.,
2011, l'ont utilisé pour déterminer l'effet de leurs procédures d'encapsulation (dans l'alginate de calcium et dans du PVA phosphorylé (« PolyVinyl Alcohol »)) sur la viabilité des cellules (Escherichia coli K-12 JM019 et Agrobacterium radiobacter J14a). Le pourcentage de cellules viables dans la culture était compris entre 54 et 74 % avant immobilisation et entre 39 et 62 % après
immobilisation. Pereira et al., 2005, se sont, quant à eux, intéressés au suivi de la viabilité et de la
morphologie des cellules (Escherichia coli XL1-blue, Streptomyces nodosus ATCC 14899) au cours
du temps (sur plusieurs dizaines de jours) une fois encapsulées dans l'alginate de calcium. En plus des données récoltées sur la viabilité, l'analyse des images prises des sections des billes (de 10 µm)