Chapitre 2 - Matériel et méthodes
3. Les systèmes de culture
Description du système
Les systèmes de culture appelés « sélectiostat » ont été conçus par le Laboratoire d’Océanographie de Villefranche (fig. 1). Il s’agit de photobioréacteurs plans en acier inoxydable et plexiglas, d’un volume utile maximal de 1,9 L. L’épaisseur de culture est de 6 cm. La géométrie plane permet des mesures fiables et simples du PAR et de la turbidité. La source lumineuse est une lumière blanche, fournie par un panneau de LEDs (Nichia NVSL219BT 2700°K) placé derrière le sélectiostat. Une régulation thermique indépendante est assurée par un cryostat à circulation (Lauda Proline RP845). Les sélectiostats possèdent une double enveloppe située dans leur structure métallique, qui permet de réduire au maximum l’inertie thermique de la culture. Un système de rideau de bulles d’air (filtré sur 0.2 µm) le long des parois transparentes permet de limiter l’installation d’un biofilm.
Le sélectiostat est instrumenté avec différents capteurs :
- un capteur plan du PAR (Photosynthetically Active Radiation) placé derrière la culture, face à la source lumineuse (Skye PAR Quantum Sensor) ;
- un capteur de turbidité, qui mesure l’atténuation d’un faisceau lumineux à 750 nm à travers l’épaisseur de la culture. Une turbidité de 0 équivaut donc à un milieu parfaitement transparent, pour lequel le faisceau lumineux n’est pas atténué, et une turbidité de 100 à un milieu opaque.
- Une sonde de pH et température (Mettler Toledo InPro 4800/750).
48 Figure 15 : Photographie légendée d'un sélectiostat et de son instrumentation.
Tous les instruments de mesure, exceptée la sonde à oxygène, sont connectés à une interface numérique, le logiciel Odin (fig. 2), qui permet d’enregistrer les mesures en ligne, avec une acquisition toutes les 2 minutes pour le PAR, la turbidité, le pH, la température et l’oxygène dissous. Ce logiciel contrôle également l’intensité lumineuse, la vitesse de la pompe péristaltique (Gilson Minipuls 3) qui alimente les cultures en continu, et le rideau de bulles d’air.
Cette interface commune permet également d’exercer des rétrocontrôles sur la culture (fig. 2). Le premier permet d’assujettir la vitesse de la pompe de dilution à la mesure de turbidité. Quand celle-ci dépasse une valeur de consigne, la vitesse de la pompe est augmentée, ce qui a pour effet de diluer la culture. La régulation de la turbidité (et donc de la concentration cellulaire) est donc très précise. Le second permet d’assujettir l’injection de CO2 à la mesure du pH, et de maintenir ce dernier proche d’une valeur de consigne. Enfin, les rideaux de bulles sont stoppés 5 secondes avant les mesures de turbidité et de PAR, afin qu’elles ne soient pas perturbées.
Sonde de température et de pH
Capteur de turbidité
Capteur de PAR
Rideau de bulles d’air
Agitateur magnétique Sonde à oxygène
Régulation thermique
Electrovannes de contrôle des gaz Canules d’apport et de prélèvement du milieu
49 Figure 16 : Représentation simplifiée du système de culture en continu pour les expériences d'évolution en laboratoire. Intérêt du système
Ces sélectiostats ont été spécialement conçus pour d’une part maintenir des cultures de microalgues en continu pendant plusieurs mois, et d’autre part assurer une maitrise fiable des mesures en ligne et du contrôle des conditions de culture, notamment de la température et de la lumière, les 2 facteurs choisis dans cette étude pour exercer une pression de sélection. Le corps en inox du sélectiostat permet de réduire l’inertie thermique du système, et la géométrie plane a été choisie pour simplifier le champ radiatif et faciliter les mesures optiques. Les mesures en ligne à haute fréquence permettent de suivre en temps réel l’état de la culture, et de vérifier que ses paramètres, notamment le pH, la température, et la turbidité sont conformes aux consignes entrées dans le logiciel ODIN qui pilote le système. Ce dernier enregistre également la vitesse de la pompe de dilution en continu, et donc le débit d’entrée du milieu de renouvellement. La relation entre la vitesse de la pompe et le débit est régulièrement vérifiée par pesée. Les mesures à haute fréquence du taux de dilution (débit/volume de la culture) et de la turbidité permettent de calculer le taux de croissance quasiment en continu. Il est donc important que ces deux mesures soient acquises avec le maximum de précision. Toutes les 8 semaines, les sélectiostats sont vidés, nettoyés, stérilisés, et redémarrés avec la culture récupérée. A cette occasion, et afin d’assurer la stabilité du dispositif, les différents capteurs sont vérifiés et, si nécessaire, calibrés à nouveau.
3.2. Les multicultivateurs
Les multicultivateurs (Multi-Cultivator MC 1000-OD, Photon Systems Instruments) permettent des études comparatives de cultures dans des conditions identiques, que l’on peut facilement standardiser. En effet, chaque système dispose de 8 flacons de culture cylindriques, de 85 mL de volume utile chacun (fig. 3). La régulation thermique, assurée un bain thermostaté, est commune à toutes les cultures, alors que l’intensité lumineuse des LED (lumière blanche) peut être réglée
Logiciel ODIN Pompe péristaltique Cryostat Source lumineuse Sonde pH, température, turbidité, PAR
Trop-plein de culture Apport de milieu Régulation thermique Air CO2
50 indépendamment. Chaque culture est équipée d’un bullage d’air filtré sur 0.22 µm, qui assure, outre un apport de CO2, l’homogénéisation, et d’un capteur de densité optique (DO) à 720 nm. Le pH n’est par contre pas régulé.
Les mesures de température et de densité optique sont enregistrées avec des fréquences respectives de 2 et 10 minutes, ce qui permet un suivi quasi continu de ces 2 paramètres.
Figure 17 : Système de culture Multi-Cultivator MC1000-OD Intérêt d’une culture comparative en conditions identiques
Pendant une expérience d’évolution en laboratoire, les cultures dans les sélectiostats sont soumises à des stress de différentes intensités. Elles sont donc constamment en train de s’acclimater, parallèlement au processus d’évolution que l’on essaye d’instaurer. Pour déterminer si les variations phénotypiques observées sur les cultures sont dues à l’acclimatation ou à l’évolution, il est nécessaire de pouvoir dissocier ces 2 influences. Pour cela, nous avons régulièrement réalisé au cours du processus de sélection, en conditions standardisées et non stressantes, des cultures en multicultivateur que l’on a inoculées avec des microalgues prélevées dans les sélectiostats. Cela permet de « réinitialiser » la culture et d’effacer au moins partiellement son historique récent de stress. On suppose ainsi que les analyses biochimiques faites sur ces cultures mettent en évidence des caractéristiques uniquement imputables à l’évolution des microalgues, et non à leur acclimatation aux conditions de stress. Il est donc nécessaire de choisir des conditions de culture standardisées et inchangées tout au long de l’expérience. En effet, le phénomène d’acclimatation d’une population à ses conditions de culture ne peut pas être évité. Si l’acclimatation aux conditions de stress du sélectiostat est effacée, elle est en fait remplacée par l’acclimatation aux conditions standardisées. Malgré tout, quand ces dernières restent identiques, on peut considérer que l’acclimatation des cultures est toujours la même, et donc que les modifications mises en évidence d’un cycle de sélection à l’autre (voir plus pas) sont bien dues à l’évolution de la culture.