SYNTHESE D’ANTIBIOTIQUES

2.4.1. Production de substances volatiles (HCN)

La cyanogenese a été évaluée d’une part sur milieu liquide, et d’autre part sur milieu solide. La première a été effectuée selon la méthode décrite par Meena et al., (2001), où les isolats bactériens sont cultivés pendant 48h à28°C sous agitation (180rpm) dans des Erlens Meyer contenant 50ml de TSB.

Des bandelettes de papier Whatman n° 1 (0.5/10cm) saturées avec une solution de picrate alcaline, sont suspendues verticalement dans ces Erlens. Le picrate de sodium présent dans le papier change de couleur en fonction de la production d’HCN (Verma et al., 2007).

La seconde est une méthode adaptée de celle de Lorck (1948). Sur une gélose nutritive additionnée de 4.4g/l de glycine, les isolats bactériens sont ensemencés par strie, un disque de papier Whatman n°1 saturé en picrate alcalin sont déposés dans les couvercles des boites, ces dernières sont scellées au parafilm et incubées inversées à 28°C pendant 4 jours (Ahmad et al., 2008 ; Trivedi et al., 2008). Le virage de la couleur: du jaune vers le brun clair au rouge brun indique respectivement une production modérée et élevée d’HCN par la bactérie productrice (Trivedi et al., 2008). Dans les deux cas, trois répétitions ont été effectuées, le témoin négatif est représenté par un milieu sans inoculum, alors que le témoin positif est représenté par la souche de référence P. fluorescens CHAO.

2.4.2. Production de substances diffusibles : Phénazines

2.4.2.1. Sélection des souches antagonistes in vitro

La détection d’éventuelles activités antifongiques et antibactériennes, a été effectuée chez 14 souches sélectionnées. Ces souches ont été confrontées à une collection de phytopathogènes composée de six isolats fongiques (Fusarium oxysporum f.sp. lycoprsici, Fusarium oxysporum f.sp. albedinis, Fusarium solani, Pythiumultimum, Rhizoctonia solani et Phytophtora infestans) et trois isolats bactériens (Escherichia coli M400, Pseudomonas diminitus, Micrococcus paratrophus).

Le pouvoir antimicrobien des isolats est déterminé par la mise en culture duelle des isolats avec des champignons et bactéries phytopathogènes. Les méthodes utilisées sont respectivement celles décrites par Vincent et al. (1991) et Veselova et al. (2008).

Pour la première, les isolats bactériens sont étalés sur un front d’une boite de Pétri contenant du PDA et incubés pendant une nuit à 28°C, à l’opposé un disque fongique de 8mm venant d’une culture de 7 jours est déposé. Les boites sont alors incubées pendant une semaine à température ambiante, et la distance séparant les bactéries du mycélium est mesurée, et est comparée au témoin ne contenant que le disque fongique inoculé sur un front de la boite.

Le pouvoir antibactérien est évalué sur gélose LB. Les isolats y sont ensemencés pendant 48h à 28°C. Les bactéries sont alors tuées par les vapeurs de chloroforme, et recouvertes ensuite par 3ml d’une gélose (0.6% d’agar) en surfusion contenant 107

cellules indicatrices.

Après incubation de 18 à 20 h à 28°C, l’activité antibactérienne se traduit par des halos clairs autour des colonies des bactéries testées. Le témoin est représenté par la culture de la souche de bactérie indicatrice sur une gélose préalablement exposée au chloroforme.

2.4.2.2. Détection et extraction des métabolites à effet antibiotique

La recherche de métabolites à effet antibiotique a été effectuée chez les souches ayant manifestées un pouvoir antagoniste vis-à-vis des souches pathogènes fongiques et bactériennes. La production d’antibiotique de nature phénazinique se manifeste par des colonies pigmentées aussi bien sur King B, sur gélose à l’extrait de levure (NYA), que sur PDA; qui lorsqu’elles sont examinées sous UV à 365nm révèlent des zones sombres autour des colonies produisant des phénazines (Thomashow et Weller, 1988).

La production des phénazines, in vitro, a été recherchée dans le milieu NBY (nutrient broth yeast extract) additionné de glucose à 2% (James et Gutterson, 1986). Les composés phénaziniques ont été extraits selon la méthode décrite par Thomashow et Weller (1988) et modifiée par Bonsall et al. (1997), les isolats bactériens sont mis en incubation pendant 72 h à 28°C, sous agitation permanente (180 rpm). Les cultures sont acidifiées (pH2) avec du HCl concentré, puis extrait deux fois avec le même volume de benzène ou d’acétate d’éthyle. La phase organique contenant les phénazines, est d’abord filtrée à travers du sulfate d’ammonium anhydre, ensuite évaporée sous vide dans un rotavapor à 55° C (James et Gutterson, 1986), et l’extrait sec est remis en suspension dans du méthanol ou dans de l’acétonitrile à 0.1% d’acide tri-fluoro-acétique (Delanay et al., 2001).

2.4.2.3. Quantification des phénazines

Une courbe standard établie avec la phénazine-1-carboxylate (PCA) purifié qui nous a été offert par le Dr Thomashow (Université de Pullman Washington, USA); les absorbances des extraits sont déterminées par spectrophotométrie à 364 et 251 nm (Spectrophotomètre: Cecil CE3021 UV.Visible 3000series), et les valeurs correspondantes sont déduites en microgramme.

2.4.2.4. Analyse des composés à effet antibiotique: phénaziniques

Puisque, les Pseudomonas spp. produisant les phénazines, synthétisent une mixture de composés phénaziniques (Delanay et al., 2001), il semble impératif d’essayer de fractionner l’extrait brut avant de chercher à l’identifier.

a. Chromatographie en couche mince

La première étape consiste alors à fractionner l’extrait par chromatographie sur couche mince (CCM) sur gel de silice (0.25 mm d’épaisseur). Le volume de dépôt est de 150µl à (le standard étant la PCA), et plusieurs phases de migration ont été essayées et celui qui a été retenu est composé de chloroforme/acétate d’éthyle (1/1). Après migration et évaporation du solvant, les plaques sont visualisées sous UV (365 nm) et les différentes fractions de l’extrait brut sont délimitées, et leurs rapports frontaux calculés (Rf).

Chaque bande de silice est gratée puis mise en suspension dans du méthanol, et est énergiquement agitée afin d’en extraire le composé. Cette opération est répétée 5 fois. Les fractions organiques collectées pour chaque bande sont soumises à une concentration par évaporation (dans les mêmes conditions que précédemment). Ces fractions ont été balayées par spectroscopie UV (dans une solution à 0.1N NaOH) afin de les déterminer les fractions ayant une activité antifongique. Cette méthode a été adaptée par Pierson et Thomashow (1992) selon Toohey et al. (1965).

b. Spectroscopie UV-visible

Parallèlement, une spectroscopie UV-visible (Spectrophotomètre: Cecil CE3021 UV.Visible 3000 series) a été menée, où plusieurs longueurs d’ondes ont été utilisées pour essayer de déterminer la composition de l’extrait brut (afin de déterminer les pics d’absorptions maximales). Le choix de ces longueurs d’ondes (237, 246, 251, 259, 313, 364, 367 et 376 nm), a été fait en fonction des maximums d’absorbance de composés phénaziniques connus (Fernandez et Pizzaro, 1997; Delanay et al., 2001; Mavrodi et al., 2001; Veselova et al., 2008).

c. Chromatographie liquide haute performance (HPLC)

Pour confirmer la présence et la quantification des composés phénaziniques, l’extrait brut a fait l’objet d’une analyse par HPLC. Un protocole général d’HPLC a été développé pour ces métabolites par Delanay et al. (2001). Le système utilisé, est le système Agilent 1100 series doté d’un détecteur spectrophotométrique UV-visible DAD (Diode Array detector G1315A), et une colonne ACE C18 (4.6x250 mm). Les expérimentions ont été réalisées en phase inverse, la phase stationnaire de la colonne C18 est constituée de groupements organiques apolaires, et la phase mobile (solvant) est polaire, elle consiste en un mélange d’ACN à 0.1% TFA dans de l’eau bi distillée avec un gradient continu (linéaire 35 :65). L’extrait est remis en suspension dans 0.6 ml de méthanol pur et filtré (0.45µm). Le débit du solvant est de 0.7 ml /min, et la longueur d’onde de détection est comprise entre 250-450 nm. Les composés phénaziniques sont identifiés par leurs temps de rétention et leurs spectres UV (Delanay et al., 2001 ; Veselova et al., 2008).

d. Determination du poids moléculaire des molécules actives par GC/MS

Cet extrait a fait l’objet d’une chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectroscopie de masse (GC/MS) afin de déterminer : le poids moléculaire et confirmer l’identité des molécules. Les conditions de la GC/MS effectuée sont celles décrites par Saosoong et al. (2009) avec un chromatographe de type Hewlett Packard 6890 couplé à un spectrophotomètre de masse quadripôle modèle 5973. Des aliquotes de 5µl de l’extrait méthanolique sont injectés en mode splitless avec l’hélium comme gaz vecteur ayant un débit de 1 ml/min, dans une colonne capillaire HP5MS (30 m x 0,25 mm x 0, 25 µm). La température de l’injecteur est de 250°C (60°-250° pente 6°/ min). Alors que les températures du Spectromètre de masse sont : interface (280°C), source (230°C), quadripôle (150°C). Les spectres sont enregistrés en mode SCAN en considérant la variation m/z de 5 à 280, avec une énergie d’ionisation de 70eV.

3. RESULTATS