Métabolites impliqués dans la suppression
2. MATERIEL ET MÉTHODES
2.2. PRODUCTION DE MÉTABOLITES SECONDAIRES 1. Synthèse des sidérophores
La détection de la synthèse des sidérophores a été réalisée dans le milieu O-CAS (overlayed chrome azurol S) en boite de Pétri selon les méthodes modifiées décrites par Pérez-Miranda et al. (2007). Le milieu CAS est préparé selon Schwyn et Neilands (1987), mais ne contenant pas de substances nutritives et l’agar est remplacée par l’agarose comme substance gélifiante. A cet effet, les bactéries sont cultivées sur gélose au succinate (Meyer et Abdallah, 1978), et sur gélose à l’hydrolysat de caséine (Serino et al., 1995) pendant 18h à 28ºC. La détection des sidérophores est accomplie en recouvrant la culture bactérienne de 10ml de milieu CAS modifié. Après, au moins 15 min un changement de couleur dans la couche de gel rajoutée autour des colonies du microorganisme producteur est observé. La couleur vire du bleu vers le pourpre pour les sidérophores de type catéchol, et du bleu vers l’orange pour les sidérophores de type hydroxamate (Schwyn et Neilands, 1987).
L’influence du milieu de culture sur la production des sidérophores a été testée. En plus, du milieu au succinate (MS), quatre autres milieux ont été utilisés: KB (King B), à l’hydrolysat de caséine (CAA), PDB (Potato Dextrose Broth) et le TSB (Tryptic Soy Broth), le pH est ajusté à 7.
L’estimation de la production de sidérophores a été effectuée par la méthode de Jacques et al. (1995). Toute la verrerie a été rincée à l’acide chlorhydrique concentré, puis à l’eau bidistilée avant stérilisation. Les bactéries provenant de cultures de 18h sont transférées dans 50ml de milieu liquide au succinate (MS), incubées en agitation continue (150 rpm) pendant 40h à 28ºC.
Le taux de croissance est évalué par spectrophotométrie à 540nm, où une unité d’absorbance équivaut à 5.108 (U.F.C). Après centrifugation (4000 rpm/15min à 4 ºC), l’absorbance du surnageant est déterminée à 400 nm (spectrophotomètre : JENWAY 6300) et la quantité de sidérophores calculée en utilisant le coefficient d’absorbance molaire (ε = 27000 cm2
. mmol-1) selon la méthode décrite par Jacques et al. (1995). Parallèlement, on a essayé de quantifier la production d’acide salicylique dans le milieu à l’hydrolysat de caséine CAA, dans des conditions de culture similaires à celle décrite pour les sidérophores. L’établissement d’une courbe d’étalonage avec du 3,5-dinitro-acide-salycilique permet de déterminner la concentration d’acide salicylique produit (Serino et al., 1995).
L’influence de l’effet de l’incorporation de FeCl3 (100µm/l) dans le milieu MS est effectuée dans les mêmes conditions que précédemment, et est comparée aux résultats précédents (Georges et Meyer, 1995).
Les surnageants obtenus pour quantifier les sidérophores ont été stérilisés par filtration (0.22 µm). Ont fait l’objet d’une électrophorèse sur papier Wattman nº 3, révélés par la solution CAS selon les conditions décrites par Schwyn et Neilands (1987), et font l’objet d’analyses chimiques pour déterminer la nature des sidérophores produits (Baakza et al., 2004). La synthèse de sidérophores s’accompagne par la synthèse de protéines cytoplasmiques, celles-ci sont réprimées en présence de fer. Les culots cellulaires sont alors récupérés, pour rechercher ces protéines cytoplasmiques (IRCP :Iron Repressed Cytoplasmic Proteins) selon la méthode décrite par Georges et Meyer (1995).
2.2.1.1.Electrophorèse des sidérophores
Une électrophorèse sur papier est appliquée aux surnageants préalablement stérilisés. Le tampon de migration est constitué de 24,3 ml de pyridine et 5,7 ml d’acide acétique glacial complété avec de l’eau distillée à 1l, le pH est de 5.6. La migration se fait à 30V/cm2
pendant 1heure. Le papier est séché à l’étuve, est révélé par la solution CAS sur les deux faces. Le développement d’une coloration rose indique la présence de sidérophores (Schwyn et Neilands, 1987).
2.2.1.2. Détermination de la nature chimique des sidérophores a. Les hydroxamates
- Test au FeCl3 (Neilands, 1981): 1 à 5ml d’une solution de chlorure ferrique à 2 % est rajoutée à 1ml de filtrat. La formation d’une couleur rouge à pourpre indique la présence de sidérophores. Un maximum d’absorbance entre 420 à 450nm indique la présence de sidérophores de type hydroxamate.
- Test au tetrazolium (Snow, 1954): l’ajout de 1 à 2 ml d’NaOH concentrée à 1 ml de filtrat enrichie avec du sel de tetrazolium, donne une couleur rouge en présence d’hydroxamates.
b- Les catécholates
- Test d’Arnow (Arnow, 1937) : s’effectue par, l’ajout de 0.1ml de HCl (5N) et 0.5ml de réactif (20% NaNO2 et 20% de Na2MoO4) à 1ml de filtrat. Lorsqu’une couleur jaune se développe, on rajoute alors 0.1ml de NaOH (10N), si une coloration rouge est observée, le volume est complété à 5ml, et l’absorbance est déterminée à 515nm.
- Test au FeCl3 (Neilands, 1981): 1ml de FeCl3 à 2% est rajouté à 1ml de filtrat. Un maximum d’absorbance à 495 nm indique la présence de ferri-sidérophores de type catécholate.
c. Les carboxylates
- Test Shenker et al. (1992): 1ml de CuSO4 (250µM) et 2ml de tampon acétate (pH 4), sont additionés à 1ml de filtrat. Le complexe cuivreux formé présente un maximum d’absorption entre 190 et 280 nm (spectrophotomètre : Cecil CE3021 UV/Visible 3000series).
2.2.1.3. Synthèse des IRCP (Iron Repressed Cytoplasmic Proteins)
Pour la lyse cellulaire, les culots cellulaires sont suspendus dans 1 ml de tampon phosphate 0.1M (pH 7), et soumis à une sonication (Soniprep 150 MSE) à 10µ pendant 30s (l’opération est répétée 5 fois).
Pour une purification partielle des protéines solubles, les surnageants sont récupérés après centrifugation (13200 rpm / 45 mn à 4ºC). Ces surnageants sont complétés à 1.5ml avec du tampon phosphate auquel on rajoute de la polymine P (concentration finale 0.1%). La précipitation des protéines est alors effectuée par saturation à 50% avec du sulfate d’ammonium, et incubation pendant la nuit à 4ºC.
Le précipité protéique fait l’objet d’une dialyse (Vivaspin Concentrators de Millipore), par solubilisation dans 1ml de tampon Tris-HCl 0.125M (pH 6.8). Les protéines sont alors quantifiées par la méthode de Bradford, et font l’objet d’une électrophorèse SDS-PAGE avec un gel à 5% de polyacrylamide selon la méthode de Laemmli (1970). La détection des bandes protéiques est révélée par la méthode conventionnelle au Bleu Brillant de Coomassie R-250 (Blum et al., 1987).
2.2.2. Synthèse de l’acide indole acétique (AIA)
2.2.2.1. Estimation de la production d’AIA
La production d’IAA est déterminée selon la méthode standard (Bric et al., 1991). Une colonie isolée est étalée sur gélose Luria-Bertani additionnée de : 5 mM de L- tryptophanne, 0.06% de SDS, et 1% de glycérol. La gélose est recouverte de papier Whatman n° 1 (80mm de diamètre), puis incubée à 28°C. Le papier est récupéré, puis traité avec le réactif de Salkowski (2% de FeCl3 à 0.5M dans 35% d’acide perchlorique). Les disques de papier filtre sont saturées dans une boite de Pétri en les plongeant directement dans le réactif, après 10 à 30 min. La production d’IAA et/ou de ses analogues se manifeste par la formation d’un halo rose rouge autour des colonies, et pour les souches productrices d’autres types d’indoles la coloration est jaune à jaune brune (Naik et Sakthivel, 2006).
2.2.2.2.Quantification de l’AIA
La quantification d’AIA et de ses dérivés a été évaluée par une méthode colorimétrique (Loper et Scroth, 1986; Bric et al., 1991; Glickmann et Dessaux, 1995). Un volume de 100µl d’une culture fraîche (Absorbance600 = 0.7) sont inoculées dans 100ml de TSB (Tryptic Soy Broth) dilué au demi, et additionné ou non de L-tryptophanne (200µg/ml). Après une incubation à 28°C et à l’obscurité pendant 72h et sous agitation permanente (150 rpm), les cellules sont séparés par centrifugation (4000g / 10min), et le surnageant est filtré. A 1ml de filtrat 2ml du réactif de Salkowski sont ajoutés, la suspension est vortexée puis incubée à l’obscurité pendant 20min, l’absorbance est mesurée à 535 nm (Gravel et al., 2007). Le développement d’une coloration rose est l’indicateur de la production d’AIA (Tarnawski et al., 2006; Ahmad et al., 2008). La concentration d’AIA et de ses dérivés, est obtenue par extrapolation des valeurs des souches productrices par rapport à une courbe standard, établie à partir d’une série de dilutions d’AIA (Sigma-Aldrich) à 50µg/ml dans du TSB (Gravel et al., 2007).