Identification phenotypique des isolats

L’identification préliminaire des espèces de Pseudomonas produisant le pigment fluorescent, est essentiellement basée sur les caractéristiques morphologiques (morphologie cellulaire), la coloration de Gram, la mobilité, la recherche de la catalase et de l’oxydase, arginine dihydrolase, voie d’utilisation du glucose, ainsi que l’étude des caractéristiques physiologiques et biochimiques selon: Holt et al. (1994) et Bossis et al. (2000).

Les caractéristiques spécifiques et intra spécifique ont été réalisées selon le schéma (Fig.7) de caractérisation du groupe Pseudomonas fluorescens / putida proposé par Digat et Gardan (1987) et les clés dichotomiques (Fig.8 A et B) proposées par Jacques (1994) et Bossis (1995) pour l’identification des Pseudomonas spp. fluorescents saprophytes.

Les pricipaux milieux représentés par l’Annexe I, ont été utilisé pour les tests tel que: - Production des pigments sur King B (KB).

- Croissance à 41° et à 4° C.

- La lyse de la gélatine et celle du Tréhalose (Lyse de la gélatine et du Tréhalose) - Utilisation du géraniol et Méso- Inositol.

- Utilisation des sucres: D mannose, D fructose, amidon, mannitol, arabinose, lactose, ribose, raffinose, D glucose.

- Utilisation des acides aminés: L valine, β alanine, L arginine.

- Utilisation des acides organiques: citrate, acétate, lactate, succinate et malate.

-Identification par l’utilisation des plaques API 20 Ne, selon les recommandations de Biomerieux Marcy l’étoile France.

Hormis les tests où l’on mentionne les conditions de culture et d’incubation, tout les tests ont été effectués avec des cultures en phase de croissance (18 à 24h) sur gélose nutritive (NA, nutrient agar) et incubés à 28º C. Les suspensions bactériennes ont été préparées dans de l’eau physiologique stérile ou dans une solution tampon (MgSO4-7H2O 100mM, pH7) selon les techniques de Lelliot et Stead (1987). Les concentrations des suspensions bactériennes ont été déterminées par photométrie, en déterminant l’absorbance des cultures à 625nm. Pour une concentration de l’ordre 107

-10⁸ cellule/ml, une absorbance de l’ordre de 0.08 à 0.1 équivaut 0,5 Mc Farland (Ausubel et al., 1991).

Figure 7: Schéma général de caractérisation du groupe Pseudomonas fluorescens-putida (Digat et Gardan, 1987).

Figure 8 : Clé dichotomique pour l’identification des souches appartenant aux espèces P. fluorescens et P. putida . A :selon Jacques (1994) et B selon Bossis (1995).

P. aureo.: Pseudomonas aureofaciens; P. chloro.: P. chlororaphis; P. fluo.: P. fluorescens; P. put.: P. putida; L-ara: L- arabinose; Den.: Denitrification; Lev.: Levan; L(+) tart.: L(+) tartrate; L-trp.: L-tryptophane.

*Production de pigment fluorescent: la production du pigment fluorescent a été recherchée sur milieu KB. Après une incubation de 24 à 96 heures entre 27-28ºC, le développement du pigment fluorescent a été révélé à l’œil nu ou sous UV (254 et 366nm).

*Coloration de Gram: la coloration a été effectuée selon la méthode classique. Parallèlement, un test plus rapide, a été effectué. Deux gouttes d’une solution d’hydroxyde de potassium (KOH 3%), sont mises en contact avec une crème bactérienne sur une lame en effectuant un mouvement circulaire. La solution de KOH devient visqueuse en présence de bactéries à gram négatifs. La réaction est considérée positive si la viscosité est obtenue après 30s (Bourgault et Lamothe, 1988).

*Mobilité: la mobilité des bactéries a été étudiée par observation microscopique à l’état frais sur cultures en phase de croissance dans une goutte d’eau distillée stérile entre lame et lamelle, et confirmée par repiquage sur milieu spécifique : mannitol-mobilité.

*Catalase: la catalase a été révélée en déposant sur une lame en verre propre, une colonie bactérienne en présence de H₂O₂ à 10 volumes. Une réaction catalase positive se traduit par l’apparition de bulles, suite au dégagement gazeux d’oxygène (Lévy et al., 1992).

*Oxydase: l’oxydase a été recherchée sur papier filtre selon la technique de Kovacs (1956) : une colonie est étalée sur un disque imprégné de diméthyl-p-phénylène diamine préalablement trempé dans de l’eau distillée stérile. Une réaction positive se traduit par l’apparition d’une couleur rouge violacée au bout de 10 secondes ; la réaction est tardive entre 10 et 60 secondes, et elle est négative après 60 secondes.

*Arginine dihydrolase: complexe enzymatique capable de dégrader l’arginine en anaérobiose, agissant selon deux types de réaction envisageables. La première réaction est une transformation de l’arginine en citrulline et ammoniaque par son activité dihydrolase. La seconde est une décarboxylation de la citrulline en ornithine et ammoniaque. Certains Pseudomonas spp. sont capables de dégrader l’arginine, des tubes contenant le milieu de Falkow (0.5% arginine) inoculés ont été recouverts d’une couche de vaseline et incubés à 28ºC pendant 5 jours. Une réaction positive se traduit par l’apparition d’une coloration rouge pourpre suite à l’alcalinisation du milieu dû à la présence de l’ammoniaque (Hildebrand, 1988).

*Fermentation des sucres: la fermentation des sucres (glucose, lactose) ainsi que la production de H₂S ont été recherchées sur le milieu d’identification combiné : milieu Hajna-Kligler, en ensemençant abondamment la surface par des stries ou par inondation, le culot est inoculé par simple piqûre centrale avant de les mettre à l’étuve pendant 24h à 30ºC.

*Test d’hypersensibilité: le test d’hypersensibilité (HR) a été effectué avec des suspensions bactériennes (10³) en eau physiologique stérile. L’inoculation de la face inférieure des feuilles de tabac d’une plante à 6 feuilles, par infiltration, à l’aide d’une seringue hypodermique. Les plants de tabac inoculés ont été déposés dans le laboratoire, à la température 20-25 º C. le témoin négatif est inoculé avec de l’eau physiologique stérile. Le développement de collapse au niveau des zones inoculées 2 à 3 jours après, traduit une réaction d’hypersensibilité positive (Klement, 1963).

*Dénitrification: la réduction des nitrates a été testée selon la méthode décrite par Roussel-Delif et al. (2005). Des tubes contenant du bouillon nutritif à 0.2 % de KNO3 et une cloche,pour détecter la formation de gaz, sont inoculés et incubés à température ambiante (22 à 25ºC).

La présence de nitrate est révélée après 7 jours par addition de quelques gouttes du réactif de Nessler, la réaction positive donnant une coloration orange à rouge brique. L’adjonction de poudre de Zinc sous forme de ZnCl₂ va permettre la réduction des nitrates en nitrites et donc de confirmer le pouvoir dénitrifiant des isolats. Les isolats capables de produire du gaz ainsi que ceux réduisant les nitrates en nitrites sont aussi considérés comme des dénitrifiants potentiels.

*Production de levane sucrase: la recherche de levane sucrase a été effectuée sur milieu NA à 5 % de sucrose. Après ensemencement du milieu, et incubation de 3 à 5 jours à température ambiante, le développement de colonies blanchâtres, convexes et brillantes indique la présence de levane sucrase (Lelliot et Stead, 1987; Hildebrand, 1988).

*Protéolyse: les tubes contenant le milieu gélatine ont été ensemencés avec une crème bactérienne de 24 heures et incubés pendant 72 heures à 25º C. Les tubes inoculés ainsi que le tube témoin sont chauffés légèrement (+5 º) pour vérifier la liquéfaction de la gélatine. La protéolyse se traduit par la liquéfaction du milieu, par comparaison à un témoin négatif qui doit rester solide (Lelliot et Stead, 1987).

*Pouvoir pectolytique: les tubercules de pomme de terre sont d’abord débarrassés de résidu de terre en les passants sous le l’eau. Ensuite, ils sont désinfectés (10mn) en passant dans une solution alcoolique (éthanol à 70%), et une seconde solution contenant de l’hypochlorite de sodium. Après rinçage à l’eau distillée stérile, les tubercules sont ensuite tranchés et déposés dans des boites de pétri contenant de l’eau physiologique stérile, quelques gouttes d’une suspension bactérienne en phase de croissance sont déposées sur les tranches. Après 7 à 14 jours, la réaction est considérée positive par l’apparition de pourriture qui s’accompagne d’une forte odeur (Cooksey et al., 1990).