Synthèse, purification, et caractérisation des nanoparticules

Les nanoparticules d’oxyde de manganèse (MnO) utilisées dans ce projet ont été développées par l ’étudiant à la maîtrise Mathieu Létourneau, et les nanoparticules d’oxyde de gadolinium (Gd2O3), par l’étudiant au doctorat Luc Faucher. Les principes de la synthèse, ainsi que la caractérisation des nanoparticules synthétisées, sont décrits dans leurs travaux de recherche.

3.1.1.1 Synthèse de MnO

La synthèse des nanoparticules de MnO est basée sur une méthode par décomposition thermique en deux étapes (Section 2.4.3.1). La procédure de synthèse consiste, dans une première étape, à former un complexe d'oléate de manganèse à partir de chlorure de manganèse et d'oléate de sodium, avec un reflux de 12 heures dans un mélange de n-hexane, éthanol et eau. Après séparation et lavage de la phase organique, il faut distiller le n-hexane et ensuite dissoudre l’oléate de manganèse dans l’hexadécène, un solvant à haut point d’ébullition. C’est dans ce dernier que la décomposition thermique d’un tel complexe s’effectue afin de produire des nanocristaux d’oxyde de manganèse recouverts d’oléate.

Puisque les nanoparticules synthétisées sont recouvertes d'oléate, leur dispersion n’est possible que dans des solvants organiques comme le chloroforme ou le toluène. Pour être utilisées en milieu biologique, les nanoparticules doivent être recouvertes d'un ligand hydrophile. Ici, l'acide dimercaptosuccinique (DMSA) ainsi qu’une petite quantité de polyéthylène glycol (PEG) ont été ajoutés à la réaction afin de procéder à un changement de ligand. Il a été démontré par Fauconnier [133] et par Auffan [107] que le DMSA peut être efficacement utilisé comme ligand sur des nanoparticules à applications biomédicales. Les nanoparticules de fer encapsulées dans du DMSA sont faiblement cytotoxiques et n’ont aucun effet génotoxique [107]. Le polyéthylène glycol (PEG) sert d’agent stabilisant lors de l’échange de ligand. L’ajout de PEG empêche l’adsorption des protéines sur la surface des nanoparticules ainsi que le processus d’opsonisation. Ce processus survient lorsque les macrophages reconnaissent les nanoparticules comme des corps étrangers et procèdent à leur élimination [134].

3.1.1.2 Synthèse de PEG-Gd

O

Les nanoparticules d’oxyde de gadolinium recouvertes de polyéthylène glycol bis(carboxymethyl)ether (PEG- Gd2O3; MW = 600) sont obtenues par une méthode similaire à la synthèse polyol [86, 111, 113, 135]. Ainsi, il est possible d’obtenir une distribution particulièrement étroite de nanoparticules de tailles inférieure à 5 nm. Les caractéristiques ultra-fines et monodisperses de ces particules permettent un contact optimal entre l’eau et les atomes paramagnétiques à la surface des nanoparticules. Ainsi on augmente le nombre de molécule d’eau dont la relaxation sera accélérée par la présence de l’agent de contraste.

Un sel de gadolinium hydraté, Gd(NO3)3∙6H2O, est entièrement dissout à une température de 100°C dans du polyéthylène glycol diacide. Le mélange réactionnel doit être chauffé à une température de 140°C pendant une heure afin de permettre la formation d’un précurseur. Par la suite, la solution est portée à 180°C pendant une période de quatre heures, ce qui permettra la formation des nanoparticules d’oxyde de gadolinium. Il est possible d’augmenter la température du mélange réactionnel suffisamment pour former les cristaux d’oxyde puisque le PEG a une température d’ébullition élevée. Finalement, le mélange est refroidi et purifié.

3.1.2 Purification des nanoparticules

Il est possible de purifier une suspension de nanoparticules à l’aide de différentes techniques tel les que la dialyse, la chromatographie par exclusion de taille, la centrifugation, etc. La méthode de purification élaborée au laboratoire s’applique aux deux types de nanoparticules employées lors de ces travaux (MnO et Gd2O3). Elle est constituée d’une étape de dialyse dans l’eau nanopure et d’une centrifugation. Les suspensions colloïdales décrites précédemment ont été disposées dans une membrane de dialyse (10 000 MW), déposée dans un bain d’eau contenant un litre d’eau nanopure (> 18 MΩ/cm) en mouvement. Par la suite, l’eau est changée au moins 5 fois pendant 28 heures. Cette technique permet d’éliminer la majeure partie des réactifs de départ n’ayant pas été utilisés lors de la réaction (ions métalliques, surfactants). Ensuite, les solutions sont récoltées et centrifugées afin d’éliminer les agrégats (2200 G, température et pression ambiantes, 15 min.).

3.1.3 Caractérisation des nanoparticules

Les travaux de caractérisation phys ico-chimique des nanoparticules ont été réalisés par mes collègues Mathieu Létourneau (MnO) et Luc Faucher (Gd2O3). La présente section de ce mémoire portera sur les techniques spécifiquement utilisées afin d’effectuer un contrôle de qualité avant chaque procédure d’internalisation cellulaire :

− la détermination du diamètre hydrodynamique des nanoparticules par diffusion de la lumière en mode dynamique (DLS) et;

− la détermination des propriétés relaxométriques grâce à un relaxomètre (1H-RMN).

Ces mesures ont été réalisées sur les solutions d’agent de contraste de manière routinière avant chacune des expériences de culture cellulaire, afin de s’assurer de la stabilité colloïdale et des caractéristiques relaxométriques des suspensions de nanoparticules utilisées.

3.1.3.1 Détermination du rayon hydrodynamique des particules (DLS)

La diffusion de la lumière en mode dynamique (DLS) est une méthode reposant sur le mouvement brownien, permettant d’évaluer le diamètre hydrodynamique des nanoparticules. Il comprend non seulement les nanoparticules et leurs ligands, mais aussi la sphère d’hydratation qui les entoure. La diffusion d’une particule dans un liquide dépend uniquement de leur taille ainsi que de la viscosité du milieu dans lequel elle baigne.

Pour ce faire, un rayon laser (He-Ne, λ : 633 nm) passe à travers l’échantillon et un détecteur placé à 173° par rapport au faisceau incident (backscatter detection) capte le signal transmis. Ce positionnement permet de minimiser les interférences telles que des signaux provenant d’impact avec de la poussière ainsi que des phénomènes de diffusion multiple. La quantité de lumière qui traverse l’échantillon est contrôlée par un atténuateur. Si la soluti on à analyser contient une très forte concentration de particules, l’atténuateur diminue la quantité de lumière qui traverse la solution afin de compenser pour la forte diffusion provoquée par la présence importante de nanoparticules. En cas inverse, l’atténuateur augmente la quantité de lumière qui traverse l’échantillon afin de garder un signal convenable malgré la faible présence de nanoparticules.

L’intensité de la lumière parvenant au détecteur varie dans le temps. Il est possible de faire une corrélation entre le patron du signal ondulatoire de la lumière a un moment donné(t) et celle celui obtenu quelques instants plus tard (t+δt, où δt est très petit). Puisque le mouvement brownien à un caractère rapide et aléatoire, la correspondance entre le patron initial et le patron à temps t = x diminue dans le temps jusqu’à ce qu’elle atteigne zéro. La pente descendante permet d’obtenir la taille hydrodynamique de la particule. Plus la particule est petite, plus le taux de variation est élevé (Figure 31)[136].

Il est possible de déterminer la taille d’une particule en observant le temps de corrélation. Le temps de corrélation est une propriété physico-chimique d'une substance indiquant sa facilité de déplacement au sein

d'une autre par le phénomène de diffusion. Dans ce cas-ci, il s’agit de la facilité de mouvement d’une particule.

Figure 31: Fluctuation de l’intensité du signal en fonction du temps pour de grosses (en haut) et de petites (en bas) particules.

(Figure tirée de Jones, 2010 [136])

Ainsi, pour un même milieu, une particule ayant un temps de corrélation court a nécessairement une petite taille puisque son mouvement brownien est rapide. Dans le cas inverse, lorsque le temps de corrélation est long, la particule bouge lentement dans la matrice, ce qui indique que sa taille est plus grosse. Si les particules agglomèrent dans la suspension, la taille captée aura considérablement augmenté. Il est donc possible de suivre l’agglomération de particules en suspension grâce à cet appareil.

Un des plus grands avantages de cette technique est sa rapidité. Le protocole de préparation ainsi que le temps nécessaire à l’obtention des résultats sont rapides. Ainsi, l’appareil peut révéler très efficacement les effets d’agglomérations. Afin de faire cette étude, il suffit de déposer 1 mL de la solution de nanoparticules dans une cellule de 1 cm3 et de la déposer dans le Zetasizer Nano ZS de la compagnie Malvern Instruments. Le rayon hydrodynamique des particules peut alors être comparé aux résultats de microscopie électronique à transmission (MET).

3.1.3.2 Mesure des propriétés relaxométriques (

H-RMN)

Afin de mesurer les propriétés relaxométriques des suspensions de nanoparticules d’agents de contraste, un relaxomètre est utilisé (Minispec 60mq, Bruker). Cet appareil de RMN est muni d’un électroaimant de 60 MHz (1,43 T). L’appareil permet de déterminer les propriétés relaxométriques de solutions à forte teneur en protons d’hydrogène (solutions aqueuses, gras, molécules organiques, polymères).

3.1.3.2.1 Relaxation longitudinale (T

)

Afin de mesurer le temps de relaxation longitudinal e T1, l’appareil utilise une séquence d’inversion-

récupération (Figure 32) [35]. Lors de cette séquence, le vecteur d’aimantation est basculé à 180°. Suite à un délai (τ), une seconde impulsion de 90° cette fois le fera basculer dans le plan xy.

Figure 32 : Séquence d’inversion-recouvrement (T1). (Figure tirée de Kastler, 2003 [35])

Cette étape sera répétée lors du retour à la valeur initiale du vecteur d’aimantation sur l’axe des z. Par contre, chacune des répétitions aura un temps d’attente de plus en plus long entre l’impulsion de 180° et celle de 90° (τ1 < τ2 < τ3). Ainsi, il est possible de visualiser la courbe de croissance de l’aimantation macroscopique de l’échanti llon, et par le fait même de mesurer le T1 (Figure 10).

3.1.3.2.2 Relaxation transverse (T

)

La séquence permettant de mesurer le temps de relaxation transverse (T2) est celle de Carr-Pucell-Meibom- Gill (Figure 33). Cette séquence d’écho de spin (Section 2.1.9; Annexe B), permet de visualiser la courbe de relaxation transverse avec un grand nombre de points.

Cette séquence applique une impulsion de 90° faisant basculer le vecteur d’aimantation dans le plan xy. Après un certain temps (τ), une seconde impulsion, cette fois -ci de 180° est effectuée, permettant le

rephasage des spins. Lorsque les spins sont en phase, un écho sera généré, let le T2 sera mesuré à partir de plusieurs échos. Après l’écho, les spins perdent graduellement leur cohérence. Suite à un délai équivalent à un second temps (τ) une seconde impulsion de 180° est lancée ce qui permettra à nouveau un rephasage.

Il est alors possible, sans refaire d’impulsion à 90°, d’acquérir d’autres mesures aux temps 2 TE, 3 TE, 4 TE, etc. La courbe obtenue illustre la relaxation transverse (T2) (Figure 13) [35]. Dans cette situation, l’impulsion à 90° n’est pas répétée au début de chacune des mesures . Cette séquence est donc beaucoup plus rapide que celle en écho de spin (Section 2.1.9; Annexe B).

Figure 33: Séquence de Carr-Purcell pour le temps de relaxation transverse (T2). (Figure tirée de Kastler, 2003 [35])

3.1.3.2.3 Propriétés relaxométriques (r

, r

et r

/r

)

La relaxivité d’un agent (r1 ou r2) est l’augmentation du taux de relaxation (1/T1 ou 1/T2) des protons à une concentration de 1 mM. Elle permet de comparer la performance des agents de contraste entre eux. Afin de calculer r1 et r2, il est essentiel de mesurer la teneur en éléments paramagnétiques (Mn, Gd). En effet, la relaxivité représente le taux de relaxation (1/Ti) normalisé à la concentration de produit paramagnétique

dans la suspension. Pour ce faire, un dosage est effec tué selon le protocole décrit à la section 2.4.6. Finalement, le rapport r2/r1 caractéristique à chaque agent de contraste permet de classifier la substance en fonction de son potentiel en tant qu’agent « négatif » ou « positif ». Plus ce rapport est près de l’unité (1.0), meilleur est l’agent de contraste positif (section 2.1.6).