Synthèse du gabarit peptidique

La synthèse du gabarit peptidique se fait par synthèse supportée en phase solide (SPPS)

selon les principes développés par R.B. Merrifield en 1960

¹⁸⁴

et reste similaire à celle utilisée avec

le mime de G-quadruplexe parallèle. Toutefois des modifications sont nécessaires pour répondre

183 Bonnet, R.; Murat, P.; Spinelli, N.; Defrancq, E., Click-click chemistry on a peptidic scaffold for easy access to tetrameric DNA structures. Chem Commun 2012,48 (48), 5992-5994.

184 Merrifield, R. B., Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide. J Am Chem Soc 1963,85 (14), 2149-2154.

Chapitre 2 : Mimes antiparallèles de quadruplexe Synthèse et caractérisation d’un mime de i-motif

123

aux critères imposés pour l’obtention d’un édifice antiparallèle. Ainsi il présente deux fonctions

oxyamines et deux fonctions azotures sur sa face supérieure. Chacune de ces fonctions est

positionnée de manière à favoriser la formation du i-motif (Figure 86). Une biotine est insérée sur

sa face inférieure pour des études de surface. Deux stratégies ont été utilisées pour l’introduction

de ces fonctions : soit l’introduction d’acides-aminés modifiés (« building block ») lors de la

synthèse peptidique, soit par la post fonctionnalisation de chaînes latérales de lysines via

l’utilisation d’esters actifs.

Structures chimiques du « gabarit diagonal » 6.

Figure 86

Outils pour l’insertion des fonctions utiles aux chimies click

1a.

i) Insertion de la fonction biotine

Lors de la synthèse, la fonction biotine est introduite sur le gabarit peptidique sous forme

d’un « building block » préformé compatible avec la SPPS. Comme c’était le cas lors de la

synthèse du mime parallèle 1, celui-ci est constitué d’une lysine fonctionnalisée sur sa fonction

amine Ɛ par une biotine via la firmation d’une amide. Afin que cette lysine puisse être incorporée

en synthèse peptidique lors d’une synthèse de type Fmoc/tBu, l’amine α de la molécule a été

protégée par une fonction Fmoc (pour Fluorenylmethyloxycarbonyle). Ainsi l’obtention du

« building block » nécessite dans un premier temps d’activer la fonction carboxylique de la biotine

par un groupement N-hydroxysuccinimide. La DCC (N,N'-dicyclohexylcarbodiimide) est utilisée

comme agent de couplage. Par la suite, la biotine activée 7 est couplée à la Fmoc-Lys-OH en

milieu basique à pH 8 en présence de DIEA(N,N-Diisopropyléthylamine, Schéma 3). Après

recristallisation, le produit est obtenu avec un rendement global de 79% et sera utilisé lors de la

synthèse peptidique.

6a 6b

124

Schéma 3 Synthèse du « building block » Fmoc-Lysine(Biotine)-OH 8

ii) Insertion des fonctions oxyamines protégées.

Deux stratégies sont possibles pour l’insertion de la fonction oxyamine sur le gabarit

peptidique reposant chacune sur la fonctionnalisation en Ɛ de la lysine par un espaceur dérivé de

l’acide 2-aminooxyacétique (Schéma 4). La première consiste en la post fonctionnalisation du

gabarit par l’utilisation de l’acide Boc-aminooxyacétique activé sur sa fonction acide carboxylique

par un groupement N-hydroxysuccinimide. Ceci est effectué en utilisant la DCC comme agent de

couplage. Ainsi le linker 9 est obtenu avec un rendement de 87%. La seconde stratégie utilise une

oxyamine protégée par un groupement 1-éthoxyéthylidène (Acm). Elle a été développée pour

introduire la fonction oxyamine sous forme de « building block ». En effet, il a été montré que

ceci n’était pas possible en utilisant un groupement tert-butoxycarbonyle (Boc) car, malgré la

protection, l’oxyamine conserve une certaine réactivité qui peut conduire à des acylations

secondaires lors de la synthèse peptidique

¹⁸⁵

. De plus, le groupement 1-éthoxyéthylidène présente

l’avantage de pouvoir être enlevé dans des conditions acides plus douces. Ce groupement

protecteur est obtenu via la substitution nucléophile de l’ethyl-N-hydroxyacétimidate sur l’acide

iodoacétique. Par la suite, l’activation de la fonction acide carboxylique de ce dernier (composé

10a) se fait par une fonction N-hydroxysuccinimide dans les mêmes conditions que

précédemment. Le composé 10b, obtenu avec un rendement global de 69%, peut lui aussi être

introduit par post fonctionnalisation du gabarit. Lors des différentes stratégies utilisées pour les

synthèses de mime, il a été choisi d’introduire les oxyamines sur le châssis par post

fonctionnalisation via les composés 9 ou 10b afin de pouvoir garder une certaine modularité lors

des synthèse (voir partie III).

185 Foillard, S.; Rasmussen, M. O.; Razkin, J.; Boturyn, D.; Dumy, P., 1-Ethoxyethylidene, a New Group for the Stepwise SPPS of Aminooxyacetic Acid Containing Peptides. J Org Chem 2008,73 (3), 983-991.

7

Chapitre 2 : Mimes antiparallèles de quadruplexe Synthèse et caractérisation d’un mime de i-motif

125

Schéma 4 Synthèse des « Linkers » présentant les fonctions oxyamines protégées

iii) Insertion des fonctions azotures

L’insertion des fonctions azotures sur le gabarit peptidique se fait sous forme d’un

« building block » en utilisant la Fmoc-azidonorleucine. Ceci peut être réalisé à condition de

respecter certaines conditions comme éviter l’utilisation d’agents réducteurs utilisés pour la

déprotection des groupements alloc (allyloxycarbonyle) tel que les complexes de palladium. Bien

que ce produit soit commercial, il a été choisi de le synthétiser au laboratoire par commodité.

Comme pour la Fmoc-Lysine(biotine)-OH, le produit de départ est la Fmoc-lysine-OH. La

fonction azoture est obtenue par l’utilisation d’un réactif de diazotransfert 11 qui réagit en milieu

basique et en présence d’un catalyseur métallique sur la fonction amine en Ɛ de la lysine (Schéma

5)

¹⁸⁶

. De nombreux travaux ont été rapportés décrivant l’utilisation de réactifs de diazotransferts

pour obtenir des fonctions azotures sur les amines de nombreux composés

¹⁸⁷

. La

Fmoc-azidonorleucine 12 est obtenue avec un rendement considéré comme quantitatif et une pureté

suffisante pour être utilisée pour la synthèse peptidique (supérieure à 95%, analysée par phase

inverse, RP-HPLC).

Schéma 5 Synthèse de la Fmoc-azidonorleucine 12 par diazotransfert

186 Nyffeler, P. T.; Liang, C.-H.; Koeller, K. M.; Wong, C.-H., The Chemistry of Amine−Azide Interconversion:  Catalytic Diazotransfer and Regioselective Azide Reduction. J Am Chem Soc 2002,124 (36), 10773-10778.

187 Goddard-Borger, E. D.; Stick, R. V., An Efficient, Inexpensive, and Shelf-Stable Diazotransfer Reagent:  Imidazole-1-sulfonyl Azide Hydrochloride. Org Lett 2007,9 (19), 3797-3800.

9

10b 10a

11

126

Synthèse du gabarit peptidique

1b.

La synthèse du gabarit peptidique est réalisée par SPPS (Synthèse Peptidique en Phase

Solide) en utilisant la stratégie Fmoc/tBu du C-terminal vers le N-terminal. La SPPS repose sur

une succession d’étapes de couplages et de déprotection permettant l’élongation d’une séquence

peptidique greffée sur une résine de polymère. Elle consiste à coupler à chaque étape, via la

formation d’une liaison peptidique, un nouvel acide aminé sur la séquence greffée la résine. Cet

acide aminé devra être protégé sur son amine α afin qu’un seul acide aminé puisse être ajouté lors

de chaque couplage. Suit alors une étape de déprotection de l’amine α du dernier acide aminé

accroché pour pouvoir effectuer le couplage suivant. L’intérêt de cette technique est qu’elle

permet d’éliminer par filtration les excès d’acides aminés utilisés lors des différentes étapes de

couplages quand le peptide synthétisé reste accroché sur la résine. Cette stratégie nécessite

également la protection des fonctions réactives sur les chaines latérales des différents acides

aminés par des groupements orthogonaux adaptés aux conditions de couplage et de déprotection

utilisées pendant l’allongement du peptide.

Dans notre stratégie, la résine utilisée pour toutes les synthèses est la Fmoc-gly-SASRIN

^®

.

Cette résine a pour particularité d’être préfonctionalisée et d’être compatible avec les étapes

suivantes de couplage. Les amines α des différents acides aminés sont protégées par un

groupement Fmoc qui peut être aisément éliminé par β-élimination lors des cycles de déprotection

par l’utilisation de la pipéridine à 10% dans le N,N-Diméthylformamide (DMF). Les couplages

sont effectués en utilisant du PyBOP (benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium

hexafluorophosphate) comme agent activateur en présence et de DIEA. La synthèse a été effectuée

en couplant par SPPS les différents acides aminés nécessaires à l’obtention du gabarit peptidique.

En fin d’élongation, le peptide 13 est détaché de la résine par l’utilisation de TFA (acide

trifluoroacétique) à 1% dans le dichlorométhane avant d’effectuer une cyclisation. Cette dernière

est réalisée en présence de PYBOP comme agent de couplage et de DIEA. Elle est réalisée en

milieu dilué (10

^-3

M) afin d’éviter tout risque de polymérisations du peptide. De plus il est à noter

que la cyclisation s’effectue sur une glycine en C-terminal car cet acide aminé non chiral permet

d’éviter tout risque d’épimérisation. L’étape suivante consiste à déprotéger les amines en Ɛ des

lysines (Boc) de la molécule 14. Ceci se fait en milieu acide fort (TFA à 50%) en présence d’eau

et de triisopropylsilane (TIS) comme piégeurs des tertiobutyles formés. Les amines libres sont

alors fonctionnalisées par les linker oxyamines choisis 9 et 10b. Le gabarit protégé 6b est obtenu

après purification par RP-HPLC avec un rendement total de 41%. Sinon les fonctions oxyamines

Chapitre 2 : Mimes antiparallèles de quadruplexe Synthèse et caractérisation d’un mime de i-motif

127

pour former le peptide 6a. Ce dernier est obtenu avec un rendement total de 39% suite à une

purification dans les conditions décrites précédemment (Schéma 6).

Schéma 6 Synthèse du « gabarit diagonal » 6

Dans le document Synthèse et utilisation de mimes de quadruplexes pour l'évaluation de ligands (Page 133-138)