Assemblages du mime de i-motif par ligations chimiosélectives

Deux stratégies sont possibles pour effectuer les assemblages par ligation chimiosélective et ainsi

former le mime de i-motif. En effet, il est possible de commencer les assemblages soit par la ligation oxime

puis continuer par la CuAAC (stratégie 1) soit d’effectuer les opérations inverses (stratégie 2). Afin

d’étudier la polyvalence de la synthèse, les deux stratégies ont été réalisées (Schéma 8). La stratégie 1

nécessite de débuter les assemblages en utilisant le gabarit peptidique 6a possédant ses fonctions

oxyamines libres. Par contre dans le cas de la stratégie 2 , il est nécessaire de travailler avec des fonctions

oxyamines protégées pour empêcher toutes réactions secondaires de ces fonctions très réactives sur des

impuretés aldéhydiques éventuellement présentes dans le milieu (utilisation du gabarit 6b). Il est donc

nécessaire d’effectuer une étape de déprotection des oxyamines sur l’intermédiaire de réaction 20. Il a été

choisi d’utiliser le groupement 1-éthoxyéthylidène comme groupement protecteur des oxyamines car il est

plus labile en milieu acide que le groupement Boc. Ceci permet d’éviter ainsi une dégradation des ODN

(perte de bases) lors des synthèses par un milieu trop fortement acide.

16

17

Chapitre 2 : Mimes antiparallèles de quadruplexe Synthèse et caractérisation d’un mime de i-motif

129

Schéma 8 Synthèse du mime de i-motif 5 : par la stratégie 1 : ligation oxime puis CuAAc (à droite) ou

par la stratégie 2 :CuAAc puis ligation oxime (à gauche)

Stratégie 1: ligation oxime puis CuAAC

3a.

i) Ligation oxime en première étape

La synthèse du i-motif par cette stratégie commence par la formation de liens éthers

d’oxime entre l’oligonucléotide 3’-aldéhyde 17 et le gabarit peptidique 6a. Le couplage est réalisé

en milieu tamponné d’acétate d’ammonium (0,4M à pH 4,5) pendant deux heures à 55°C. Un

6a 6b 17 18 19 20 5 17 18

130

excès d’oligonucléotides 3’-aldéhyde 17 (1,2Eq) est ajouté du fait de la présence

d’oligonucléotides diols 16 non oxydés lors de l’étape précédente (observé par spectrométrie de

masse). L’analyse puis la purification de l’échantillon se font par RP-HPLC. Lors du couplage, un

second pic avec un temps de rétention de 21,2min est présent (Figure 87A). Il correspond à un

produit de monocouplage (déterminé par spectrométrie de masse). Après purification par phase

inverse, l’intermédiaire 19 est obtenu avec un bon rendement (59%). Ce produit a ensuite été

caractérisé par ESI-MS (Spectrométrie de Masses par Ionisation Electrospray, Figure 87B) et par

dichroïsme circulaire (voir partie 4).

Chromatogramme RP-HPLC (A) et caractérisation ESI-MS (B) de l’intermédiaire

Figure 87

19

ii) CuAAC en seconde étape

La seconde étape conduisant à l’obtention du i-motif est la CuAAC entre l’intermédiaire

19 et l’oligonucléotide 5’-alcyne 18. A ce stade, plusieurs conditions de réaction ont été testées.

Ainsi, les premiers essais ont été effectués en présence de sulfate de cuivre(II) réduit par

l’ascorbate de sodium en cuivre I pour la catalyse de la réaction. Cependant aucune formation de

produit n’a été observée dans ces conditions après une nuit de réaction. L’utilisation des

micro-ondes pourrait être une option intéressante pour la formation accélérer la formation des produits

cependant leur utilisation entrainant la dégradation des liens éther d’oxime, celles-ci ne pourront

pas être utilisées dans notre cas. Les travaux se sont alors orientés vers l’utilisation de

micropoudre de cuivre en présence de tertbutanol pour effectuer cette réaction de ligation

CuAAC. La micropoudre s’oxyde en cuivre I en présence d’oxygène et le tertbutanol permet de

stabiliser ce dernier. Cependant quelques inconvénients incombent à cette technique : tout d’abord

0 5 10 15 20 25 30 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 Au Time (min)

A)

B)

m/z calcd: 5060.1, found: 5057.4 [M-H] -17 19 Monocouplage

Chapitre 2 : Mimes antiparallèles de quadruplexe Synthèse et caractérisation d’un mime de i-motif

131

la cinétique de la réaction est lente (une nuit) et ne permet pas de contrôler la quantité du Cu

^I

formé. Or ceci conduit à la formation de Cu

^II

en solution qui risque d’induire des coupures

oxydantes sur les ODNs

¹⁹¹

. De ce fait, nous avons donc choisi d’utiliser un ligand du cuivre, le

THPTA (tris[(1-hydroxypropyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine) pour effectuer la réaction. En

effet il a été rapporté que l’utilisation d’un ligand du cuivre tel que le THPTA ou bien encore le

TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine) pouvait permettre d’augmenter la

cinétique de réaction de CuAAC

¹⁹²

.

Structure chimique du THPTA (A) et du TBTA (B)

Figure 88

La réaction a donc été réalisée dans un tampon HEPES (100mM, pH 7,4) en utilisant le

sulfate de cuivre (2 équivalents par alcyne), du THPTA (5 équivalents par alcyne) et de

l’ascorbate de sodium (10 équivalents par alcyne). Après deux heures de réaction, les profils

HPLC observés ne semblent plus évoluer. Les analyses et les purifications ont été tentées dans un

premier temps sur colonne phase inverse, toutefois cette méthode n’est pas satisfaisante pour

séparer les oligonucléotides non couplés. C’est pourquoi ces opérations ont été effectuées par

chromatographie liquide haute performance échangeuse d’ions (IE-HPLC) sur une colonne de

type SAX(« Strong Anion Exchange », Figure 89). Cette méthode présente cependant

l’inconvénient d’apporter de nombreux sels à l’édifice qu’il est nécessaire d’éliminer par la suite.

Ainsi deux étapes de dessalage sur cartouche d’exclusion de type NAP 25 sont effectuées. Le

gabarit final 5 est obtenu avec un rendement total de 26%.

191 Sigman, D. S.; Graham, D. R.; D'Aurora, V.; Stern, A. M., Oxygen-dependent cleavage of DNA by the 1,10-phenanthroline . cuprous complex. Inhibition of Escherichia coli DNA polymerase I. J Biol Chem 1979,254 (24), 12269-72.

192 (a) Rodionov, V. O.; Presolski, S. I.; Gardinier, S.; Lim, Y.-H.; Finn, M. G., Benzimidazole and Related Ligands for Cu-Catalyzed Azide−Alkyne Cycloaddition. J Am Chem Soc 2007,129 (42), 12696-12704; (b) Lallana, E.; Riguera, R.; Fernandez-Megia, E., Reliable and Efficient Procedures for the Conjugation of Biomolecules through Huisgen Azide–Alkyne Cycloadditions. Angew Chem Int Ed 2011,50 (38), 8794-8804.

132

Chromatogramme IE-HPLC(SAX) de i-motif 5 synthétisé par la stratégie 1

Figure 89

Stratégie 2: CuAAC puis ligation oxime

3b.

i) CuAAC en première étape

La ligation CuAAC est réalisée avec les oligonucléotides 5’-alcyne 18 et le gabarit protégé

par les groupements 1-éthoxyethylidinène 6b. En effet, rappelons qu’il est nécessaire de conserver

les oxyamines protégées pour empêcher toutes réactions secondaires avec des contaminants

porteurs de fonctions aldéhydes. La réaction de CuAAC est effectuée dans les mêmes conditions

que précédemment, à savoir en utilisant du sulfate de cuivre II réduit par de l’ascorbate et

complexé par le THPTA. Après deux heures de réaction à température ambiante, le suivi

RP-HPLC indique que la quasi-totalité des oligonucléotides présentant les fonctions alcynes a été

couplée sur le gabarit peptidique. La purification peut se faire classiquement en phase inverse et le

produit 20, obtenu avec un rendement de 63%, a pu être caractérisé par ESI-MS sans difficulté

(Figure 90).

Chromatogramme et caractérisation ESI-MS de l’intermédiaire 20

Figure 90

0 5 10 15 20 25 -100 0 100 200 300 400 500 600 700 Au Time (min) 18 5 19 0 5 10 15 20 25 30 0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 Au Time (min) m/z calcd: 5312.5, found: 5311.3 [M-H] -18 20

Chapitre 2 : Mimes antiparallèles de quadruplexe Synthèse et caractérisation d’un mime de i-motif

133

ii) Ligation oxime en seconde étape

L’obtention du mime de i-motif 5 a ensuite nécessité la formation du lien éther d’oxime en

faisant réagir les oligonucléotide 3’-aldéhyde 17 sur l’intermédiaire 20. Cependant par rapport à la

stratégie précédente, une étape supplémentaire de déprotection des oxyamines est nécessaire.

Celle-ci a été effectuée en milieu TFA à 10% pendant 30 minutes. Il faut noter que ceci a été

possible car les oligonucléotides présents sur le gabarit sont composés exclusivement de bases

pyrimidiniques, moins sensibles aux conditions acides que les purines. La réaction de déprotection

a été suivie par RP-HLPC (Figure 91). Le mélange réactionnel a été directement lyophilisé sans

purification ni caractérisation du fait de sa réactivité.

Chromatogramme RP-HPLC après déprotection dans le TFA à 10% de

Figure 91

l’intermédiaire 20

Afin que la formation du lien éther d’oxime soit réalisée dans les meilleures conditions, un

excès d’oligonucléotide 17 (4Eq) a été ajouté pour former le produit final 5. La réaction est

effectuée en milieu acétate d’ammonium tamponné (0,4M ; pH 4,5) pendant deux heures à 55°C

selon les conditions classiques utilisées pour ce genre de ligation. La purification de ce produit a

également nécessité l’utilisation d’une purification par IE-HPLC (SAX, Figure 92). Le mime de

i-motif a été obtenu par cette stratégie avec un rendement total de 25%.

Chromatogramme IE-HPLC(SAX) de la synthèse du mime 5 par la stratégie 2

Figure 92

0 5 10 15 20 25 30 0,0 0,1 Au Time (min) 0 5 10 15 20 25 -100 0 100 200 300 400 500 600 700 Au Time (min) 5 17 20

134

Caractérisation par spectrométrie de masse

3c.

Quelle que soit la stratégie utilisée, le composé 5 a été tout d’abord caractérisé par

spectrométrie de masse. Dans un premier temps des analyses ont été effectuées par ESI-MS. Afin

d’arriver à caractériser l’édifice, il a été nécessaire d’utiliser des conditions décrites par l’équipe

de V. Gabelica pour caractériser les oligonucléotides dont les G-quadruplexes

¹⁹³

. Celles-ci

reposent sur l’utilisation de l’acétate d’ammonium comme contre ion en solution, qui lors de sa

vaporisation formera de l’ammoniac et de l’acide acétique. De plus, la présence d’isopropanol

comme cosolvant a favorisé les analyses (Figure 93A). Cependant la caractérisation s’est avéré

être difficile et les spectres obtenus ont été peu satisfaisants. C’est pourquoi des analyses par

MALDI (« Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry ») ont été nécessaires

(Figure 93B). Sur le spectre de masse correspondant, deux pics supplémentaires sont présents. Si

le premier correspond à la présence de ionisation double (M-2H)

^-

/2, le second est

vraisemblablement dû à une coupure induite par la technique d’un des oligonucléotides relié en 3’

sur sa fonction oxyamine. Ce phénomène a en effet déjà été observé sur de tels conjugués obtenus

au laboratoire. Toutefois les spectres obtenus dans chacun des cas ont permis de confirmer que

l’édifice obtenu 5 était celui attendu.

193 Rosu, F.; De Pauw, E.; Gabelica, V., Electrospray mass spectrometry to study drug-nucleic acids interactions. Biochimie 2008,90 (7), 1074-1087.

Chapitre 2 : Mimes antiparallèles de quadruplexe Synthèse et caractérisation d’un mime de i-motif

135

Caractérisations par spectrométrie de masse du mime 5 par ESI-MS (A) et par

Figure 93

MALDI-MS (B)

II.4. Caractérisation de la structuration en i-motif au sein du mime

Dans le document Synthèse et utilisation de mimes de quadruplexes pour l'évaluation de ligands (Page 139-146)