Synthèse chimioenzymatique du composé 4

HO COOLi O RO OH O HO O OH OH O O OH TK 4 Aldolases HPA (10) 34 DHAP (15) : R = PO3 2-DHA : R = H ^commercial HO NH2 O S S S S HO OH O S

Figure 119 : Rétrosynthèse du composé 4

La synthèse du composé 4 catalysée par la TK nécessite l’utilisation de l’aldéhyde α -hydroxylé 34 (de configuration R ou sous forme racémique). La voie reposant sur l’utilisation d’aldolases nécessite le méthional comme substrat accepteur (Figure 119).

1.5.1.1. Synthèse du substrat accepteur

La synthèse du composé 34 a été développée à partir des acides aminés correspondants (Figure 120), d’une part sous forme optiquement pure à partir de la méthionine D et L et d’autre part sous forme racémique à partir de l’acide α-hydroxylé racémique correspondant, l’acide 2-hydroxy-4-(méthylthio)butyrique 30 qui est commercial. Nous avons réalisé la synthèse des deux énantiomères (R) et (S) de l’aldéhyde 34 car ils seront nécessaires pour la mise au point du test de sélection. L’énantiomère R et le mélange racémique seront utilisés comme substrat de la TK pour accéder au composé 4.

HO NH2 O S O OH S (R)-29 (S)-29 r ac-29 OTBS O S EtO OH O S L-méthionine D-méthionine (R)-33 (S)-33 r ac-33 (R)-31 (S)-31 rac-31 HO OH O S (R)-30 (S)-30 r ac-30 Figure 120 : Rétrosynthèse de l’aldéhyde 34

Désamination nitreuse de la D-méthionine D et de la L-méthionine :

Les composés (R)-30 et (S)-30 ont été préparés par désamination nitreuse à partir de la D-méthionine et de la L-méthionine respectivement.

HO NH₂ O S NaNO₂ H₂SO₄aq. 0 - 5 °C HO OH O S D-méth ionine L-méthionine (R)-30 (S)-30

Figure 121 : Désamination nitreuse de la méthionine

Après addition lente de la solution de nitrite de sodium à 0 °C, la réaction est laissée à température ambiante pendant une nuit. La fin de la réaction est confirmée par la disparition complète de la méthionine en CCM (isopropanol / H2O 7/3). Après extraction à l’éther, les acides α-hydroxylés (R)-30 et (S)-30 sont obtenus sous forme d’une huile orange que nous n’avons pas réussi à purifier par la méthode habituelle (lavage au pentane) ou par recristallisation. La présence du proton de l’atome de carbone portant le groupement hydroxyle est confirmée par l’analyse des spectres RMN ¹H (disparition du proton de la fonction amine à 3,65 ppm et apparition du proton de l’hydroxyle à 3,4 ppm). En raison des difficultés de purification, les composés (R)-30 et (S)-30 sont engagés directement dans l’étape suivante. Le rendement de la désamination nitreuse sera donc estimé après purification des esters obtenus à l’issu de l’étape suivante (composés (R)-31 et (S)-31)

L’estérification est réalisée selon le protocole décrit par Effenberger¹⁴⁰ d’une part, à partir de composé 30 racémique commercial et d’autre part, à partir des composés (R)-30 et (S)-30 obtenus lors de l’étape précédente.

EtOH / Résine H+ CHCl₃ 85 °C HO OH O S ^EtO OH O S (R)-30 (S)-30 r ac-30 (R)-31 (S)-31 rac-31

Figure 122 : Estérification de la fonction acide carboxylique du composé 30

La réaction est réalisée en présence de résine acide dans un mélange d’éthanol absolu et de chloroforme (Figure 122) selon la méthode décrite précédemment. Le milieu réactionnel est laissé à reflux pendant 24 heures. Après filtration de la résine et évaporation des solvants sous pression réduite, le composé 31 racémique (rac-31) est obtenu sous forme d’un liquide translucide brunâtre avec un rendement de 98 %. Les composés (R)-31 et (S)-31 nécessitent une purification sur gel de silice éclair et sont obtenus sous forme d’un liquide incolore avec un rendement global pour les étapes de désamination et d’estérification de 7 et 21 % respectivement. L’estérification du groupement carboxyle est confirmée par l’analyse des spectres ¹H RMN (présence d’un triplet à 1,25 ppm et d’un multiplet à 4,2 ppm correspondant au groupement éthyle de l’ester) et ¹³C RMN (présence de deux carbones à 14,3 ppm et 61,8 ppm correspondant au groupement éthyle de l’ester). Les pouvoirs rotatoires des composés (R)-31 et (S)-31sont respectivement de + 6,9° et – 7,1°.

En conclusion, les rendements de la réaction d’estérification peuvent être considérés comme quantitatifs (en se basant sur le rendement d’estérification obtenu pour le composé rac-31). Par conséquent, le faible rendement global des deux étapes (désamination et estérification) pour les composés (R)-31 et (S)-31 peuvent être attribués à l’étape de désamination. Nous avons envisagé différentes conditions réactionnelles (variation de la concentration et du nombre d’équivalents) sans obtenir de meilleurs rendements. Il est à noter que les rendements cités dans la littérature^141-142 pour la désamination nitreuse de la méthionine sont également faibles et varient de 14 à 17 %. Il est probable que la réaction soit perturbée par la présence de l’atome de soufre. Dans ce cas l’entité N₂O₃ réagirait avec l’atome de soufre et non l’azote pouvant ainsi conduire à une série de produits secondaires (Figure 96).

Le groupement hydroxyle du composé 31 a été protégé par un éther de silyle. EtO OTBS O S EtO OH O S ter-BuMe₂SiCl Imidazole CH₂Cl₂ 40 °C (R)-31 (S)-31 rac-31 (R)-32 (S)-32 rac-32

Figure 123 : Protection de la fonction hydroxyle du composé 32

La réaction a été effectuée dans le dichlorométhane anhydre en présence d’imidazole et de chlorure de ter-butyldiméthylsilyle (Figure 123). Après l’addition des réactifs à température ambiante, la réaction est laissée à reflux du dichlorométhane pendant une nuit. Après purification sur gel de silice éclair, les composés rac-32, (R)-32 et (S)-32 sont obtenus sous forme d’un liquide incolore avec un rendement de 90 %, 73 % et 82 % respectivement. L’analyse du spectre RMN ¹H montre la présence de trois singulets à 0,06 ; 0,08 et 0,89 ppm correspondant respectivement aux deux groupements méthyles et au groupement ter-butyle portés par l’atome de silicium. L’analyse du spectre RMN ¹³C indique des déplacements caractéristiques des substituants de l’atome de silicium à – 5 et – 4,6 ppm correspondant aux deux groupements méthyles et à 18,3 et 25,7 ppm correspondant au groupement ter-butyle. Les puretés énantiomériques des composés (R)-32 et (S)-32 sont estimées par la comparaison de leurs pouvoirs rotatoires qui sont respectivement de + 40,7° et – 40°.

Réduction partielle de la fonction ester du composé 32

La réduction partielle de la fonction ester en fonction aldéhyde a été réalisée par l’hydrure de diisobutylaluminium lithium à – 78 °C dans le dichlorométhane (Figure 124).

OTBS O S DIBAL-H CH₂Cl₂ -78 °C EtO OTBS S O (R)-32 (S)-32 rac-32 (R)-33 (S)-33 rac-33

Figure 124 : Réduction partielle de la fonction ester du composé 32

Après une addition lente de l’hydrure de diisobutylaluminium lithium , la réaction est maintenue à – 78 °C pendant une nuit. Après purification sur gel de silice éclair, les composés rac-33, (R)-33 et (S)-33 sont obtenus sous la forme d’un liquide incolore avec des rendements respectifs de 78 %, 82 % et 80 %. La réduction de la fonction ester en fonction aldéhyde est confirmée par l’analyse des spectres ¹H RMN (proton aldéhydique à 9 ?59 ppm et disparition du CH3 à 1,27 et du CH2 à 4,18 ppm de la fonction ester) et ¹³C RMN (apparition d’un

carbonyle à 203,3 ppm et disparition du carbonyle de l’ester à 173,5 ppm). Les pouvoirs rotatoires des composés (R)-33 et (S)-33 sont respectivement de + 28,8° et – 28,2°.

Déprotection de la fonction hydroxyle du composé 33

Cette étape a éte réalisée en présence de fluorure (acide hydrofluorique ou fluorure de tétrabutylammonium) et en conditions acides (Figure 125).

TBAF ou H+ O OTBS S O OH S (R)-33 (S)-33 r ac-33 (R)-34 (S)-34 rac-34

Figure 125 : Déprotection de la fonction hydroxyle du composé 33

■ Déprotection en présence de fluorure de tétrabutylammonium : Cette réaction a été réalisée

dans le tétrahydrofurane en présence de fluorure de tétrabutylammonium (TBAF) à 0 °C et a conduit à la formation d’un nouveau composé ainsi que de nombreux sous-produits qu’il nous été impossible de séparer par chromatographie sur gel de silice. Cette stratégie de déprotection a donc été abandonnée.

■ Déprotection en conditions acides : La déprotection de l’éther sylilé en conditions acides a

été réalisée en présence de résine Dowex H⁺ dans l’eau à 30 °C pendant une nuit. La réaction a été suivie par CCM et bmontre la disparition des composés 33 (rac, (R) et (S)) et l’apparition dans chacun des cas d’un seul produit majoritaire. Après élimination de la résine par filtration, les solutions aqueuses obtenues à partir des composés 33 (rac, (R)) sont engagées dans la réaction catalysée par la TK qui nous confirmera la présence du produit de couplage attendu.

Conclusion

La stratégie développée nous a conduit aux aldéhydes α-hydroxylés protégés (R)-33 et (S)-33 en quatre étapes avec un rendement global de 5 % et 13 % respectivement. L’étape critique s’est révélée être la désamination nitreuse de la méthionine D et L (7 % et 21 %). La synthèse de l’aldéhyde α-hydroxylé protégé rac-33 a été réalisée à partir de l’acide α -hydroxylé rac-30 correspondant en trois étapes avec un rendement global de 64 %.

1.5.1.2. Réaction catalysée par la TK

Pour accéder au composé 4, le transfert du groupement hydroxyacétyle du HPA sur le composé 31 (R ou racémique) est catalysé par la TK (Figure 126).

Figure 126 : Synthèse du composé 4 catalysée par la TK

La réaction est réalisée selon les conditions standards définies précédemment. Après 24 heures de réaction, l’ajout d’acide n’est plus nécessaire et la concentration en HPA déterminée par le dosage spectrophotométrique n’évolue plus malgré l’introduction de TK (Figure 124). 0,0 25,0 50,0 75,0 100,0 0 5 10 15 20 25 Temps (heures) HPA (%)

(■ : milieu réactionnel sans TK ; ●: réaction)

Figure 127 : Suivi de la concentration en HPA au cours de la synthèse du composé 4 catalysée par la TK

Les taux de conversion du HPA (compte tenu du témoin réalisé en l’absence de TK) sont de l’ordre de 85 % (Figure 127). Après une purification par chromatographie sur gel de silice (gradient cyclohexane/acétate d’éthyle) suivie d’une cristallisation, le composé 4 est obtenu sous forme d’un solide blanc avec des rendements allant de 23 % (quant la synthèse est réalisée à partir du composé 34-rac) à 35 %.

L’analyse du spectre RMN ¹H indique la présence de deux doublets à 4,43 et 4,53 ppm avec une constante de couplage de 19,2 Hz caractéristique du CH₂ en α du groupement carbonyle. De plus, l’analyse du spectre RMN ¹³C indique la présence d’un groupement carbonyle à 213,5 ppm.

1.5.1.3. Conclusion

Cette voie chimioenzymatique catalysée par la TK a permis d’obtenir le composé 4 soit à partir de la D-méthionine en 6 étapes soit à partir de l’acide α-hydroxylé rac-30 correspondant en 5 étapes, avec des rendements globaux respectifs de 2 % et 31 %. L’étape

limitante dans le cas de la D-méthionine est la désamination nitreuse ce qui est également décrit dans la littérature.

La synthèse du composé 4 catalysée par la TK montre que l’aldéhyde (R)-34 est un substrat accepteur de cette enzyme. Selon la réaction inverse, le cétose D-thréo 4 pourrait donc se comporter comme un substrat donneur de la TK dans le cadre du test de sélection.

Enfin, la stratégie de synthèse développée pour accéder à l’aldéhyde 34 nous a également permis d’obtenir l’énantiomère (S) qui nous sera utile pour la mise au point du test de sélection.

1.5.2. Synthèse du composé 4 catalysée par les aldolases

Nous avons commencé cette étude avec la FSA car compte-tenu des résultats obtenus précédemment, la FSA est la plus efficace des deux aldolases testées. La FSA (A129S) a été envisagée en présence de méthional composé commercial.et du DHA comme substrat donneur (Figure 128).

Figure 128 : Synthèse du composé 4 catalysée par les aldolases

Le méthional n’est pas soluble en milieux aqueux. L’ajout de DMF, de DMSO, d’éthanol ou de THF jusqu’à une teneur de 30 % (teneur maximale compatible avec l’activité de l’enzyme) n’ayant donné aucun résultat, un traitement en milieu acide à chaud (pH 1 à reflux pendant deux heures) a permis d’obtenir sa solubilisation. Après refroidissement à température ambiante et ajustement du pH à 7,5, la solution est directement mise en réaction avec la FSA.

Après 24 heures de réaction, la DHA est totalement consommée comme l’indique le suivi par CCM. Après purification par chromatographie sur gel de silice éclair (gradient dichlorométhane / méthanol), le composé 4 est obtenu sous forme d’un solide blanc avec un rendement de 67 %. Le produit est identifié par l’analyse des spectres RMN ¹H et RMN ¹³C qui sont identiques à ceux obtenus avec la TK.

1.5.3. Conclusion

Le composé 4 a été obtenu selon deux voies enzymatiques distinctes. La condensation de la DHA sur l’isovaléraldéhyde catalysée par la FSA mutée s’est révélée la voie la plus efficace (rendement = 67%) et la plus rapide (une seule étape). Compte-tenu des bons

rendements obtenus la réaction n’a pas été envisagée avec la FDA. La voie impliquant la TK a conduit à des rendements plus modestes avec un nombre d’étapes plus important.