Exemples d’amélioration et modification d’enzymes

Les enzymes sont particulièrement intéressantes pour produire des composés énantiomériquement purs. Cependant les applications synthétiques sont limitées par la spécificité et la sélectivité de certaines enzymes. Dans ce domaine les améliorations les plus spectaculaires sont obtenues par des méthodes de mutagenèse dirigée ou semi-aléatoire sur des résidus ou des séquences proches du site actif.

4.2.1. Amélioration ou inversion de l’énantiosélectivité

L’amélioration ou l’inversion de l’énantiosélectivité des enzymes est un challenge dans le domaine de la biocatalyse. Parmi les enzymes dont l’énantiosélectivité a été modifiée, les lipases et estérases ont été les plus étudiées. D’autres résultats intéressants ont été obtenus avec une époxyde hydrolase d’Aspergillus niger et aussi avec une enzyme qui catalyse une réaction d’aldolisation, la KDPG aldolase. Quelques exemples choisis sont indiqués dans le Tableau 3.

Enzyme Origine Mutagenèse Criblage / Sélection Amélioration Réf.

Phosphotriesterase ^Pseudonomas

diminuta

Cassette

Mutagenesis ^{Criblage colorimétrique}

• EWT = 21 / EG60A= 11000 • Enantiosélectivité inversée

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Epoxyde hydrolase ^Aspergillus

niger ^{CAST Spectrométrie de masse}

E_WT = 4,6

E_Mutée= 115 ⁵⁴

KDPG aldolase E. coli PCR infidèle ^Criblage

spectrophotométrique

Modification de la spécificité

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Tableau 3 : Exemples de modification d'énantiosélectivité de quelques enzymes.

La phosphotriesterase (PTE) de Pseudonomas diminuta catalyse l’hydrolyse d’une grande variété de composés de type organophosphates, comme par exemple des insecticides utilisés en agriculture ou des inhibiteurs de l’acétylcholine estérase (neurotoxiques). L’objectif est de créer des PTE mutées qui permettent d’améliorer son énantiosélectivité (E= 1 à 90 en faveur de l’énantiomère S pour la PTE sauvage) et également de l’inverser.

Figure 24 : Hydrolyse énantiosélective du p-nitrophényl-éthyl-phénylphosphate par la PTE

La structure du site actif de la PTE a la particularité de présenter trois poches hydrophobes impliquées dans la liaison au substrat. Ces trois poches permettent d’orienter le substrat au sein du site actif : une petite poche (qui accommode le substituant le moins encombrant), une plus grande poche (qui accommode le substituant le plus encombrant) et une autre poche pour le groupe partant. Ainsi, la modification de la petite poche par une mutation ponctuelle Gly60Ala conduit à une augmentation de l’énantiosélectivité (E) de 21 à 11000 en faveur de l’énantiomère S du p-nitrophényl-éthyl-phénylphosphate (Figure 24). Pour

la même enzyme, une inversion de l’énantiosélectivité a également pu être obtenue par différentes mutations au niveau de la grande et de la petite poche. Une PTE mutée de cette façon présente une énantiosélectivité (E) de 80 en faveur de l’énantiomère R du p-nitrophényl-éthyl-phénylphosphate⁵⁵.

L’époxyde hydrolase d’Aspergillus niger (ANEH) modifiée par mutagenèse selon la méthode « CAST » itératif a permis d’augmenter l’énantiosélectivité de 4,6 à 115 en faveur du (S)- phénylglycidyléther (Figure 25).

Figure 25 : Hydrolyse du phénylglycidyléther par l’époxyde hydrolase d’A. niger

L’ANEH a subit une série de 9 mutations au total situées à l’entrée du site actif. Ces positions ont été déterminées de façon rationnelle par étude de la structure 3D de l’enzyme²⁸.

Un autre exemple décrit par Wong et ses collaborateurs en présence d’une aldolase, la D-2-céto-3-désoxy-6-phosphogluconate aldolase (KDPG aldolase)³⁶ d’E. coli a pour objectif d’inverser l’énantiosélectvité. L’enzyme sauvage catalyse une réaction d’aldolisation entre le pyruvate et le D-glycéraldéhyde-3-phosphate (D-G3P) qui conduit au D-2-céto-3-désoxy-6-phosphogluconate. Après deux cycles de PCR infidèle et un cycle de « DNA shuffling », 1024 mutants ont été criblés à l’aide d’un test fluorimétrique. Une KDPG aldolase mutée a été sélectionnée pour sa capacité à catalyser une réaction d’aldolisation entre le pyruvate et le L-glycéraldéhyde qui conduit au L-2-hexulosonate avec un excès diastéréoisomérique supérieur à 90 % (Figure 26).

De nombreux exemples notamment dans le domaine industriel ont permis d’améliorer l’affinité d’un substrat pour une enzyme par mutagenèse. Nous allons développer des travaux menés dans le domaine pharmaceutique en présence d’une aldolase (DERA) et d’une acylase (Tabeau 4).

Enzyme Origine Mutagenèse ^Criblage

Selection ^{Amélioration Réf.}

DERA E. coli PCR infidèle GC/MS ^{Meilleure affinité pour le}

chloroacétaldéhyde

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glutaryl acylase ^Pseudonomas

SY-77 ^{Saturation de site}

Criblage fluorimétrique

Meilleure affinité pour l’adipyl-7-ADCA

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Tableau 4 : Exemples conduisant à l’amélioration de l’affinité vis-à-vis d’un substrat

Un exemple particulièrement significatif a été développé à l’échelle industrielle avec la 2-désoxy-D-ribose-5-phosphate aldolase (DERA) par la firme DSM. Cette enzyme catalyse la formation stéréospécifique de la liaison C-C selon une réaction d’aldolisation et elle peut être utilisée comme biocatalyseur pour la synthèse du (3R,5S)-6-chloro-2,4,6-tridésoxyhexapyranoside, un précurseur de la synthèse de composés de la famille de la vastatine tel que le Lipitor (atorvastatine, médicament anticholestérol le plus vendu).

Cl O O O Cl OH O (S) ^Cl OH OH O (S) (R)

DERA DERA Atorvastatine

(Lipitor^®)

Figure 27 : Double aldolisation ("tandem aldol reaction") catalysée par la DERA

Ce précurseur est obtenu grâce à la DERA selon une réaction tandem à partir de chloroacétaldehyde et de deux équivalents d’acétaldehyde (Figure 27). Cependant cette enzyme possède, d’une part, une faible affinité pour le chloroacétaldehyde et, d’autre part, elle est rapidement inactivée par les fortes concentrations en aldéhyde utilisées à l’échelle industrielle. Selon une stratégie de criblage à haut-débit en présence de fortes concentrations de chloroacétaldéhyde, l’équipe de DSM a pu identifier des DERA mutées présentant des mutations bénéfiques (obtenues par PCR infidèle). La mutation Phe200Ile (le résidu Phe200 faisant partie d’une petite poche hydrophobe proche du site actif) combinée à une modification de la partie C-terminale de l’enzyme (Tyr259 C-terminale déletée ou substituée par un pentapeptide) a permis d’obtenir des mutants dix fois plus actifs que l’enzyme sauvage en présence d’acétaldéhyde (1M) et de chloroacétaldéhyde (500 mM). Ces conditions ont été

utilisées pour la synthèse du (3R,5S)-6-chloro-2,4,6-tridésoxyhexapyranoside à l’échelle industrielle⁵³.

Un autre exemple concerne la synthèse de l’acide 7-aminodésacétoxycéphalosporanique (7-ADCA) précurseur essentiel pour la préparation par voie semi-synthétique de nouvelles classes de pénicillines. La stratégie consiste à hydrolyser la chaîne latérale du cycle β-lactame d’une pénicilline naturelle et à la remplacer par la chaîne souhaitée (Figure 28).

Figure 28 : Hydrolyse de la chaîne latérale d'une céphalosporine par une acylase

Dans ce but, une nouvelle glutaryl acylase de Pseudonomas SY-77 a été obtenue par mutagénèse par saturation de site au niveau du résidu Asn266. En effet, ce résidu est connu pour son implication dans la spécificité de la glutaryl acylase vis-à-vis de la chaîne latérale des composés de type pénicilline⁵⁵. Ainsi, l’enzyme mutée Asn266Met présente une spécificité vis-à-vis du 7-ADCA vingt fois supérieure à l’enzyme naturelle⁵⁴.