Supprimer, réduire ou compenser

O fármaco foi submetido a condições de estresse para verificar a degradação forçada da molécula. Amostras foram submetidas à HCl de diferentes molaridades para analisar a hidrólise ácida que o fármaco pode sofrer. O cromatograma obtido (1A) revela uma diminuição da área do pico para o NFX com a presença de um pico adicional bem descrito como o derivado descarboxilado, preparado posteriormente segundo método descrito por Oliveira e colaboradores (OLIVEIRA; BERNARDI; MENDES; et al., 2009) e representado na Figura 5.

Estes resultados indicam que o método proposto é específico e indicador de estabilidade para a análise de NFX nos complexos de inclusão sob as condições em estudo.

3.4.2 Linearidade

A linearidade da resposta do detector frente à variação da concentração do analito foi avaliada pela análise de soluções padrões a sete diferentes concentrações na faixa de 1 µg/mL até 30 µg/mL. Coeficientes de correlação e as inclinações foram obtidos plotando-se a área do cromatogramas obtida versus concentração teórica do fármaco, e cada curva de linearidade foi submetida à análise de regressão.

A curva de linearidade média obtida está representada na Figura 6 (y = 278941x - 887,76) com um coeficiente de correlação de 0,9996. A análise de variância aplicada demonstrou que não houve desvio da linearidade (Fcalculado > Fcrítico). Além disso, a plotagem dos resíduos exibiu padrões de

distribuição normais com os resíduos passando pelo teste de distribuição (p < 0,05), em que tudo evidencia que o método é linear nesta faixa.

3.4.3 Limite de detecção e limite de quantificação

Com a linearidade estabelecida, os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) do NFX foram determinados. O método do desvio padrão residual foi aplicado e os valores de LD e LQ foram preditos utilizando as equações 1 e 2. Os valores encontrados foram de 0,79 µg/mL para LQ e de 0,26 µg/mL para LD.

3.4.4 Precisão

A precisão do método foi avaliada pelo DPR. A repetibilidade foi obtida pela determinação da concentração de trabalho do NFX em seis amostras de complexo independentes (15 µg/mL), no mesmo dia, sob as mesmas condições experimentais. A precisão intermediária do método foi

avaliada pela determinação de três amostras a concentrações diferentes no mesmo dia (intradia) e em três diferentes dias (interdias). Os valores obtidos estão expressos na tabela 4. Observa-se que o método apresentou-se preciso, pois cada repetição apresentou valores de DPR menor que 2%.

Figura 5. Cromatograma de degradação obtido para o NFX em: (A) HCl 1M, (B) NFX descarboxilado, (C) NaOH 1M, (D) Água, (E) H2O2 20%, (F) luz UV, (G) luz VIS.

Figura 6. Representação gráfica da curva de calibração média do NFX obtida por CLAE com sua respectiva equação da reta e coeficiente de determinação (R2). Tabela 4. Dados da repetibilidade e da precisão intradia e interdias para NFX nos complexos de inclusão.

Amostra Precisão intradias Precisão interdias Média (%) DPR (%) Média (%) DPR (%) 1 (n=3) 101,7 98,73 99,94 1,05 99,34 0,83 99,82 100,37 Repetibilidade 2 (n=6) 100,67 101,22 100,93 99,94 1,13 98,72 98,58 3.4.5 Exatidão

A exatidão foi avaliada pela determinação do analito nas soluções preparadas pelo método de adição de padrão e expressada em termos de porcentagem de recuperação. Volumes variáveis de solução padrão foram adicionados a uma solução de complexo para obter valores de 80%, 100% e 120% da concentração de trabalho do NFX, correspondente a 12 µg/mL, 15 µg/mL e 18 µg/mL respectivamente. Os resultados estão expressos na tabela 5.

Tabela 5. Resultado do ensaio de exatidão para o NFX. Quantidade adicionadaa (µg/mL) Concentraçãob (µg/mL) Concentração média encontrada (µg/mL) Recuperação média (%) DPR (%) 4,5 (80%) 12 12,07 101,26 0,03 7,5 (100%) 15 14,04 99,24 1,36 10,5 (120%) 18 17,96 99,54 1,08 a

Concentração de padrão adicionado

b

Concentração média da triplicata 3.4.6 Robustez

Para demonstrar a robustez do método, modificações nos parâmetros do sistema foram realizadas fazendo mudanças nas condições cromatográficas como: alteração no fluxo de fase móvel em cerca de ± 0,1 mL/min, mudança da temperatura do forno da coluna em ± 2 ºC e ainda na proporção da fase móvel em ± 2% da sua composição orgânica. Os resultados estão sumarizados na tabela 6. A estabilidade da solução analítica também foi avaliada, garantindo-se estável por pelo menos 48 h quando armazenada a temperatura ambiente.

Tabela 6. Parâmetros da avaliação da robustez do método analítico para análise do NFX por CLAE. Variável Faixa investigada Teor (%) DPR (%) Fluxo (mL/min) (mL/min) 0,9 100,40 0,97 1,0 99,80 0,36 1,1 100,18 0,42 Temperatura 38 100,92 1,26 40 99,54 0,36 42 100,68 1,07 Proporção da fase móvel (tampão:acetonitrila) 82:18 100,12 0,32 84:16 100,72 0,88 86:14 99,86 0,74

Como resultado, não ocorreram mudanças significativas nos padrões cromatográficos levando em consideração a porcentagem de fármaco nas condições experimentais testadas, assegurando a robustez do método. 4. CONCLUSÃO

Os resultados discutidos neste apêndice demonstram que o método desenvolvido para a quantificação da HCTZ e do NFX nos complexos de CD é exato, robusto e apresenta linearidade e precisão satisfatória, sem interferência da CD utilizada na formulação bem como dos produtos de degradação. Os métodos desenvolvidos e validados por CLAE revelam resultados muito confiáveis na quantificação da quantidade de fármaco complexada, tornando-se uma ferramenta fundamental no desenvolvimento deste trabalho.

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