1. Les sulfoglycolipides diacylés
Plusieurs lipides mycobactériens sont capables de stimuler des sous-populations de lymphocytes T chez l’Homme. Parmi eux, les sulfoglycolipides diacylés (Ac2SGL) appartiennent à la famille nommée communément ‘sulfolipides’ qui sont spécifiques de Mycobacterium tuberculosis et dont les représentants majoritaires dans l’enveloppe sont tétra-acylés (Ac4SGL).103
Les Ac2SGL sont constitués d’un α,α-D-tréhalose sulfaté en position 2’ et estérifié sur les positions 2 et 3, respectivement par un acide gras banal (palmitique ou stéarique) et un acide hydroxyphtiocéranoïque.68 Ce dernier est un acide gras hydroxylé dont la longueur varie de 22 à 38 atomes de carbone. Cette longue chaîne est ramifiée par des groupements méthyles dont le nombre peut varier de 3 à 10 (8 pour la forme majoritaire des Ac2SGL). Les carbones asymétriques portant ces branchements appartiennent à la série L (c'est-à-dire 2S,4S,6S,8S,10R,12R,14R,16R), la configuration absolue de celui qui porte le groupement hydroxyle n’est pas connue104 (Figure 17).
OH OH O H O H O O O O H O O O O O3SO OH Na+ -2 3 2' 1 2 4 6 17 32
Figure 17 : Structure des formes majoritaires de la famille des sulfoglycolipides diacylés Ac2SGL.68 Il s’agit d’un tréhalose acylé en position 2 par un acide palmitique ou stéarique, acylé en position 3 par un acide hydroxyphtiocéranoïque et sulfaté en position 2’.
INTRODUCTION
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Ces Ac2SGL, présentés par la molécule CD1b à la surface des cellules dendritiques, ont la capacité d’activer des lymphocytes T CD8+ ex vivo. Le clone spécifique de ces Ac2SGL produit de l’interféron γ, qui active le pouvoir bactéricide des macrophages ainsi que de la perforine et de la granulysine qui tuent les cellules infectées et le bacille intracellulaire.105 En effet, lorsque des cellules dendritiques, infectées par M. tuberculosis H37Rv, sont incubées avec des quantités croissantes de lymphocytes T spécifiques des Ac2SGL, le nombre de bactéries vivantes diminue.
De plus, des tests effectués sur le sang de différents donneurs révèlent que seuls les patients ayant une tuberculose pulmonaire latente ou active possèdent les lymphocytes T spécifiques des Ac2SGL. Ces cellules sont donc stimulées uniquement lors d’une infection par M. tuberculosis, ce qui montre un rôle particulier de ces lipides dans la défense de l’hôte contre ce bacille.68
Les sulfoglycolipides diacylés ont une structure différente des autres antigènes connus présentés par CD1b : ils n’ont ni chaînes mycoliques ni phosphatidylinositol. Il a été montré que l’antigénicité de ces sulfoglycolipides dépendait de la présence du groupement sulfate et des deux acides gras, ce qui suggère qu’ils ne subissent aucun apprêtement dans les compartiments endosomaux par lesquels ils doivent passer pour être chargés. De plus, les sulfoglycolipides tri- et tétraacylés n’activent pas le clone spécifique des Ac2SGL, ce qui montre que ces Ac2SGL ne sont pas générés suite à l’apprêtement des formes tri- ou tétraacylées.
La structure du complexe CD1b:Ac2SGL n’est pas encore résolue. Cependant, en se basant sur les structures cristallines connues des complexes CD1b:lipide,54, 56 et en considérant les longueurs des chaînes lipidiques des Ac2SGL, on peut proposer que la plus courte des deux (palmitique ou stéarique) soit accommodée dans la poche C’, la plus longue (hydroxyphtiocéranoïque, C32) dans le canal A’-T’-F’ et la partie hydrophile exposée à la surface de la protéine, accessible aux récepteur des lymphocytes T.
Pendant l’infection, les Ac2SGL sont présentés efficacement par la protéine CD1b aux lymphocytes T CD8+ dont la fonction clé est de tuer les pathogènes intracellulaires. Ils contribuent donc activement à l’immunité contre M. tuberculosis, ce qui en fait un candidat prometteur pour l’élaboration d’un nouveau vaccin moléculaire contre la tuberculose.
INTRODUCTION
40 2. Projet de thèse
Face à la menace grandissante que représente la tuberculose, le développement d’un nouveau vaccin est devenu une priorité internationale. Dans le cadre de la recherche d’un vaccin sous-unitaire, deux classes d’antigènes semblent intéressantes. D’une part, des antigènes protéiques sont en phase avancée de tests chez l’homme comme Ag85B. D’autre part, les antigènes lipidiques montrent un intérêt grandissant dans l’immunité contre M. tuberculosis. En effet, il a été montré que des glycolipides mycobactériens sont capables d’activer des sous-populations de lymphocytes T via les protéines de présentation CD1. Au sein du programme européen TB-VAC, notre équipe travaille en collaboration avec l’équipe de G. De Libero (Bâle) sur des antigènes mycobactériens non-protéiques en vue de l’élaboration d’un vaccin sous-unitaire.
Les sulfoglycolipides diacylés (Ac2SGL) présentent une activité antigénique in vitro. Ils ont la capacité d’activer des clones de lymphocytes T CD8+, cellules présentes chez les sujets porteurs du bacille tuberculeux. Ils semblent donc avoir les activités requises pour être testés chez un modèle animal. Ces antigènes sont présentés aux lymphocytes T par la protéine CD1b à la surface des cellules dendritiques. La souris ou le rat, modèles animaux les plus couramment utilisés, ne sont pas adaptés à l’étude des Ac2SGL car ils ne possèdent que l’isoforme CD1d. Les campagnes d’immunisation doivent donc être réalisées sur des cochons d’Inde.106 De telles expériences nécessitent une quantité de produit purifié de l’ordre de 10 mg pour chaque essai. Et plusieurs essais sont nécessaires pour déterminer les meilleures conditions de vaccination : l’adjuvant à utiliser, les quantités à injecter, le nombre de rappels...
Cette famille de molécules est présente en faible quantité dans l’enveloppe de M. tuberculosis. Environ 1 mg d’Ac2SGL sont purifiés à partir de 2 L de culture de la bactérie. Si on prend en considération cette faible teneur et également la pathogénie du bacille, il n’est pas concevable de produire et purifier à grande échelle ce composé naturel. Le seul moyen d’obtenir des quantités suffisantes est par synthèse chimique. Mais étant donnée la complexité de la molécule, il est difficile de la synthétiser à l’identique. En particulier, l’acide hydroxyphtiocéranoïque, composé d’environ 40 atomes de carbone, possède de 4 à 11 centres asymétriques.
INTRODUCTION
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Le sujet de cette thèse porte sur la synthèse d’analogues de ces sulfoglycolipides afin de trouver une molécule ayant une activité antigénique comparable à celle des Ac2SGL in vitro, tout en ayant une structure la plus simple possible pour que sa synthèse soit accessible, et transférable à une production à grande échelle à moindre coût. Les analogues synthétisés ont tous la même partie polaire (2,3-diacyl-2’-sulfate-α,α-tréhalose) et diffèrent les uns des autres par la structure des chaînes lipidiques. Les tests d’activation réalisés sur ces différentes molécules ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent la présentation des antigènes aux lymphocytes T.
La première partie traitera des stratégies utilisées pour synthétiser ces analogues. Une synthèse générale du sulfoglycolipide diacylé a été mise au point puis, après avoir montré le rôle crucial de la structure fine des chaînes lipidiques, différentes stratégies ont été abordées pour synthétiser des acides gras polyméthylés chiraux.
Une fois les analogues obtenus, leur activité antigénique a été testée in vitro sur le clone de lymphocytes T spécifique des Ac2SGL naturels. Ces résultats, présentés et discutés en deuxième partie, nous ont permis d’évaluer le rôle de la structure des acides gras sur la réponse immunitaire et de trouver un analogue présentant une activité similaire à l’antigène naturel.