101
CONCLUSION - PERSPECTIVES
Dans le cadre du programme européen TB-VAC de développement de nouvelles stratégies vaccinales contre la tuberculose, notre projet s’inscrit dans la mise au point d’un vaccin sous-unitaire qui pourrait être utilisé comme rappel du BCG pour l’adulte.
Une nouvelle famille d’antigènes spécifiques de M. tuberculosis, agent étiologique de la tuberculose, a récemment été identifiée : ce sont les sulfoglycolipides diacylés (Ac2SGL). Ils sont présentés par la protéine CD1b et stimulent des clones de lymphocytes T CD8+ ex vivo. Ces cellules spécifiques des Ac2SGL sont présentes chez les sujets atteints de tuberculose active ou latente ce qui confirme l’implication particulière de ces composés dans la réponse immunitaire contre cette maladie.68 Leur rôle protecteur sur l’hôte mérite par conséquent d’être étudié.
Ces antigènes ont une structure complexe. Notamment, l’acide hydroxyphtiocéranoïque, qui estérifie la position 3 du tréhalose, est un acide dextrogyre ramifié par huit groupements méthyles pour sa forme majoritaire, et un hydroxyle. L’objectif de cette thèse était de synthétiser des analogues de ces sulfoglycolipides, estérifiés par un acide gras de structure plus simple.
Pour cela, nous avons tout d’abord mis au point une synthèse générale des sulfoglycolipides diacylés. Puis, après avoir montré l’importance des substituants méthyles de l’acide hydroxyphtiocéranoïque sur l’antigénicité des Ac2SGL, nous avons synthétisé des acides gras chiraux polyméthylés. Pour cette synthèse, la stratégie utilisée met en jeu une alkylation stéréospécifique d’un énolate qui permet d’introduire dans la configuration S les carbones asymétriques porteurs des groupements méthyles. Ainsi, des acides gras saturés et
α,β-insaturés ont été synthétisés : contenant de un à quatre groupements méthyles pour les saturés et de un à cinq pour les insaturés. Ceux-ci nous ont permis d’obtenir une série de sulfoglycolipides différant les uns des autres par la structure de la partie lipidique.
CONCLUSION - PERSPECTIVES
102
Le chargement de ces composés dans la protéine CD1b a été ensuite évalué qualitativement par électrophorèse sur gel et quantitativement par électrophorèse capillaire. Le pouvoir antigénique des analogues a été étudié par mesure de l’IFN-γ produit lors de tests d’activation in vitro et ex vivo sur une lignée cellulaire de lymphocytes T spécifique des Ac2SGL. Ces expériences ont permis de déterminer des éléments structuraux de l’antigène nécessaires au déclenchement de la réponse immunitaire.
Nous avons pu constater que, d’après les expériences ex vivo, la quantité d’IFN-γ produite augmente avec le nombre de groupements méthyles présents sur la chaîne située en position 3 du tréhalose, atteignant un palier à quatre ramifications dans le cas des analogues estérifiés par un acide insaturé. Et, de façon surprenante, alors que l’acide hydroxyphtiocéranoïque est saturé, les sulfoglycolipides estérifiés par un acide α,β-insaturé sont plus actifs que ceux contenant une chaîne saturée avec le même nombre de ramifications. Cependant, estérifié par un acide contenant deux doubles liaisons, le sulfoglycolipide perd son activité.
De plus, la configuration absolue des atomes de carbone asymétriques et la longueur des chaînes lipidiques sont des éléments importants pour la présentation des antigènes et la reconnaissance par les lymphocytes T. En effet, un acide lévogyre empêche la reconnaissance du sulfoglycolipide par le TCR, les analogues avec des chaînes courtes ne se chargent pas bien dans la protéine.
Cette étude nous a permis d’établir un premier modèle de présentation, dans lequel le positionnement de l’antigène dans la protéine CD1b est orienté par la structure des acides gras : si on inverse les deux chaînes, les acides gras semblent rester dans les mêmes poches et c’est par conséquent la tête polaire qui est tournée de 180° par rapport à l’orientation de l’antigène naturel.
Tous ces résultats nous ont conduits à sélectionner le sulfoglycolipide 90 comme l’analogue de synthèse le plus intéressant. De tous les composés étudiés, il est le plus actif, et l’ajout de groupements méthyles supplémentaires n’améliore pas significativement la réponse immunitaire. Le 2-O-hexadécanoyl-2’-O-sulfate-3-O-[(4S,6S,8S)-2,4,6,8-tétraméthyltétracos-2-ènoyl]-α,α-D-tréhalose 90 (Figure 75) a alors été synthétisé en quantité plus importante, de l’ordre de 20 mg, afin de lancer des campagnes d’immunisation in vivo. Dans un premier temps, les essais sont réalisés chez le cochon d’Inde qui s’est avéré être un bon modèle animal d’étude du rôle des protéines CD1.106 Les souris, animaux plus communément utilisés et mieux connus, ne sont pas adaptées à ces essais puisqu’elles n’expriment pas de protéines CD1b.
CONCLUSION - PERSPECTIVES 103 O3SO O H OH OH O H O H O O O O O O O -Na +
Figure 75 : Structure du composé 90, sulfoglycolipide synthétique le plus actif ex vivo.
Cette expérience est réalisée en collaboration avec l’équipe de Peter Andersen aux Pays-Bas pour la formulation du vaccin et d’Anne Rawkins en Angleterre pour l’immunisation des cochons d’Inde.
Dix cochons d’Inde ont reçu trois injections d’une préparation contenant le sulfoglycolipide 90 en formulation avec des PIM et les adjuvants DDA (diméthyldioctadécylammonium) et TDB (6,6’-dibehenoyltréhalose) à quatre semaines d’intervalle. Après un repos de six semaines, les animaux sont infectés par M. tuberculosis. La protection à l’infection est suivie chaque semaine par la pesée des animaux. Tous ceux qui perdent au moins 20 % de leur masse sont tués car considérés comme étant atteints de tuberculose sévère. A la fin de l’expérience, tous les cochons d’Inde seront sacrifiés afin d’examiner les éventuels foyers infectieux dans les poumons et la rate. Cette campagne a débuté en Novembre 2007 et dure environ un an.
Des immunisations par des extraits lipidiques ou par les Ac2SGL ont déjà été réalisées sur le cochon d’Inde mais c’est la première fois qu’un lipide de synthèse est ainsi testé pour ses propriétés protectrices. Ceci implique que les conditions utilisées (formulation, quantité injectée, nombre de rappels…) devront certainement être optimisées.
Egalement, des essais de cristallisation sont en cours dans l’équipe, réalisés par Luis F. Garcia-Allès, afin de résoudre la structure du complexe CD1b:SGL. Cette structure déterminera la façon dont les sulfoglycolipides sont ancrés dans la protéine, et permettra peut-être de comprendre pourquoi la structure des acides gras joue un rôle si important dans la reconnaissance de l’antigène par le récepteur des lymphocytes T. A plus long terme, la résolution de la structure du complexe ternaire CD1b:SGL:TCR pourra être envisagée.
CONCLUSION - PERSPECTIVES
104
Une autre application envisageable pour ces sulfoglycolipides est leur utilisation pour le diagnostic de la tuberculose. Actuellement, pour dépister cette infection, il existe le test cutané à la tuberculine, qui est un moyen de diagnostiquer des sujets ayant une tuberculose latente. On injecte une solution de protéines purifiées du bacille tuberculeux sous la peau et la lecture se fait trois jours plus tard par la mesure de la réaction cutanée engendrée.143 Cependant, ce test n’est pas significatif sur une personne ayant été vaccinée par le BCG ou, plus généralement, ayant déjà été en contact avec une mycobactérie, ce qui est le cas de la majorité de la population mondiale. Or, les sulfoglycolipides sont spécifiques de M. tuberculosis. Un diagnostic utilisant ce composé, permettrait de façon fiable, de différencier les sujets atteints de tuberculose latente, de ceux ayant reçu le BCG.
La tuberculose représente encore aujourd’hui un problème de santé publique dans le monde. La recherche de nouveaux vaccins et médicaments est indispensable pour espérer reprendre le contrôle sur cette maladie…