C.2.c Structures du CYP2C5/3LVdH en présence de substrat (DMZ ou diclofénac)

Les premières structures RX de complexes P450 de mammifère-substrat ont été publiées à la fin de ma thèse, grâce à une collaboration entre les équipes de E.F. Johnson et D. Mansuy. Une recherche systématique de nouveaux substrats du CYP2C5 a conduit à l’identification de deux substrats communs au CYP2C5 de lapin et aux CYP2C humains : le 4-méthyl-N-méthyl-N-(2- phényl-2H-pyrazol-3-yl) benzènesulfonamide (DMZ) et le diclofénac. Ces deux composés, de taille et de polarité distinctes, ont été co-cristallisés avec le CYP2C5/3LVdH (Wester et al., 2003a et 2003b). La comparaison des structures des deux complexes correspondants permet d’étudier la flexibilité conformationnelle du CYP2C5 et son importance dans la reconnaissance de substrats divers.

Figure 16 : Structure chimique et sites d’oxidation du DMZ. Les sites d’oxidation par les

CYP2C sont indiqués par des flèches. Hélice G Hélice I Met245 Lys241 Asp238 Lys105 Val106 Lys108 Glu282 Asp290 Ile286 Boucle B-C His202 Glu206 Glu297 Thr296 Thr298 Thr301 Ser479 Arg304 Boucle C-terminale Hélice F Hélice I S N O O N N

Structure du complexe 2C5/3LVdH-DMZ (résolution 2,3 Å) (Wester et al., 2003a) • fixation du substrat

Le CYP2C5 catalyse l’hydroxylation majoritaire du groupement 4-méthyle du DMZ et l’hydroxylation très minoritaire du noyau phényle-pyrazole (Figure 16).

La structure RX montre que le DMZ est placé dans un canal hydrophobe qui s’ouvre au solvant entre la boucle B’-C et les hélices I et G (le canal dont l’entrée est représentée Figure 15). Il établit des contacts purement hydrophobes avec la protéine et peut se lier au fer selon deux orientations antiparallèles :

- une orientation productive qui place le groupe 4-méthyle à 4,4 Å du fer (AC1)

- une orientation non-productive qui place le phényle du noyau imidazole à 5,9 Å du fer (AC2)

Les résidus du CYP2C5 situés à moins de 5Å du DMZ appartiennent aux 6 SRS définis par Gotoh (Gotoh, 1992) (plus deux résidus hors SRS).

SRS Résidus en contact avec le DMZ

SRS1 Leu103, Val106, Ala113, Phe114

SRS2 Leu201, Asn204, Val205

SRS3 Ala237, Ile240

SRS4 Ser289 (AC2), Asp290, Gly293, Ala294, Thr298

SRS5 Leu359, Leu363

SRS6 Phe473, Val474 (AC2)

Tableau 3 : Liste des résidus en contact avec le DMZ (dans ses deux orientations) et leur appartenance aux différents SRS.

Figure 17 : Conformation fermée du CYP2C5/3LVdH en présence de DMZ d’ après (Wester et al., 2003a) (les deux orientations du DMZ, AC1 et AC2, sont représentées).

hème Canal d’accès du solvant Hélice I Hélice G Hélice F _Boucle C-terminale Canal d’accès des substrats Boucle B-C DMZ-AC1 DMZ-AC2 Boucle B-C Canal d’accès du solvant Hélice I Boucle C-terminale Hélice G Hélice F Canal d’accès des substrats

• comparaison avec la structure du CYP2C5/3LVdH sans substrat

La structure du complexe 2C5/3LVdH-DMZ correspond à une conformation fermée de l’enzyme (Figure 17) comme observé dans la structure du P450cam avec substrat (Poulos et al., 1985). La protéine s’est contractée autour du DMZ et a restreint l’accès de l’eau au site actif grâce à un remodelage important des régions flexibles du site actif, du côté distal. Ainsi, les hélices F et G se sont translatées perpendiculairement à l’axe de l’hélice I. L’hélice I s’est légèrement courbée et une hélice B’ est apparue entre les hélices B et C pour maximiser les contacts hydrophobes avec le substrat. Comme dans le P450cam, le mouvement de l’hélice F par rapport à l’hélice I ferme le canal d’accès du solvant (Figure 17), contrôlant ainsi l’accès des protons à l’hème pendant le cycle catalytique. Ces changements de conformation et de position de l’hélice F semblent donc une caractéristique générale de la fixation des substrats aux P450 procaryotes et eucaryotes. La boucle B-C serait quant à elle une porte d’entrée flexible contrôlant l’accès des substrats au site actif.

Structure du complexe 2C5/3LVdH-diclofénac (résolution 2,1 Å) (Wester et al., 2003b) Le CYP2C5 de lapin catalyse la 4’-hydroxylation du diclofénac comme le CYP2C9 humain. Par contre, d’après des mesures de Ks à différents pH, le CYP2C5 reconnaîtrait mieux la forme neutre COOH du diclofénac.

• fixation du substrat

D’après la structure RX, les carbones 3’ et 4’ du noyau dichlorophényle du substrat sont positionnés à 4,4 et 4,7 Å du fer de l’hème. Le dilofénac interagit avec les acides aminés répertoriés dans le Tableau 4. Ses cycles aromatiques forment en particulier des interactions de type π-π avec deux résidus du site actif : Phe114 et Phe473. Le groupement carboxyle polaire du diclofénac forme des liaisons hydrogènes avec un réseau de molécules d’eau localisé dans la partie distale inoccupée du site actif et relié au squelette de la protéine (résidus Asn204, Lys241, Ser289 et Asp290) par des liaisons hydrogènes (Figure 18).

SRS Résidus en contact avec le diclofénac

SRS1 Val100, Leu103, Ala113, Phe114

SRS2 Asn204, Val205

SRS4 Asp290, Gly293, Ala294, Glu297, Thr298

SRS5 Leu359, Leu363

SRS6 Phe473, Val474

Tableau 4 : Liste des résidus situés à moins de 5 Å du diclofénac et leur appartenance aux différents SRS.

• comparaison avec le complexe 2C5/3LVdH-DMZ

Le complexe CYP2C5/3LVdH-diclofénac se distingue du complexe CYP2C5/3LVdH- DMZ par une hydratation plus importante du site actif et quelques modifications conformationnelles. Le réseau de molécules d’eau qui entoure la fonction acide carboxylique du diclofénac n’était pas présent dans le complexe CYP2C5/3LVdH-DMZ. Sur le plan

topologique, les principales différences sont constatées au niveau des portions flexibles du site actif (boucle B-C, hélice B’, hélices F et G) qui s’adaptent à la taille et à l’hydratation du substrat. Le repositionnement marqué de l’hélice B’ et de la boucle B’-C permet de maximiser les interactions de Van der Waals avec le diclofénac, substrat de plus petite taille, en tenant compte de l’hydratation de sa fonction polaire dans la partie distale du site actif. Des différences de position des hélices F et G sont également visibles alors que l’hème et l’hélice I ont une position conservée.

Le CYP2C5 stabilise donc des réseaux de molécules d’eau dans son site actif pour hydrater les fonctions polaires des substrats. Il fait également preuve d’une grande flexibilité conformationnelle pour accommoder des substrats de taille, de forme et de polarité distinctes.

Figure 18 : Hydratation de la fonction carboxyle du diclofénac dans la partie distale du complexe CYP2C5/3LVdH-diclofénac d’après (Wester et al., 2003b). Les pointillés

indiquent les liaisons hydrogènes établies entre le diclofénac, les molécules d’eau et certains résidus de l’apoprotéine.

Bilan : Les cytochromes P450 ont un repliement commun et un mode de fixation de l’hème conservé. Les principales différences spatiales sont observées dans la partie distale au niveau de régions variables très flexibles : les boucles B-C et F-G et les hélices F et G. Ces éléments mobiles contrôlent l’accès des substrats et des protons au site actif et s’adaptent à la taille, à la forme et la polarité des substrats pris en charge. Cette flexibilité conformationnelle couplée à la capacité d’hydratation des fonctions polaires des substrats explique sans doute