D.4.b Bilan des études topologiques

Au début de ma thèse, aucune donnée topologique sur le CYP2C8 (pharmacophore, modèles 3D ou mutagenèse) n’avait été publiée. Par contre plusieurs études portaient sur le CYP2C9. Pharmacophore des substrats et modèle d’interaction du sulfaphénazole

Deux équipes, issus du laboratoire de Daniel Mansuy et de la société Pfizer, ont déterminé les motifs structuraux communs aux molécules reconnues par le CYP2C9 (ie. « le pharmacophore ») par modélisation moléculaire et expériences biochimiques.

En superposant 8 substrats et l’inhibiteur sulfaphénazole, l’équipe de Pfizer a proposé un premier pharmacophore des molécules reconnues par le CYP2C9 (Smith and Jones, 1992; Jones et al., 1996). Tous les composés étudiés possèdent un groupe donneur de liaisons hydrogènes situé à 6,7 ± 0,8 Å du site d’hydroxylation et à 4 ± 0,5 Å d’un site accepteur de liaisons hydrogènes de la protéine. La liaison hydrogène établie avec l’enzyme forme un angle de 133 ± 21° avec l’axe passant par le site de métabolisme et le groupe donneur de liaisons hydrogènes des substrats.

Au laboratoire, une étude sur les dérivés d’acide tiénilique (Mancy et al., 1995) a permis de souligner l’importance de la fonction acide de ce substrat dans la reconnaissance par le CYP2C9. En effet, lorsque cette fonction acide est remplacée par un groupe hydrophobe ou un donneur de liaisons hydrogènes, toute affinité pour le CYP2C9 est perdue. L’acide tiénilique formerait donc une liaison ionique avec le CYP2C9, nécessaire à sa reconnaissance. Il en serait de même pour la plupart des substrats du CYP2C9, chargés négativement à pH physiologique. Cette hypothèse est étayée par une étude sur des dérivés du diclofénac (Mancy et al., 1999). La substitution de la fonction carboxylate par un alcool supprime la 4’- hydroxylation du diclofénac spécifique du CYP2C9. Fort de ces résultats, 12 substrats du CYP2C9 (incluant des dérivés anioniques de l’acide tinélique) ont été superposés, en utilisant la (S)-warfarine et la phénytoïne comme supports. Le pharmacophore résultant indique les contraintes géométriques suivantes : la charge négative des substrats est située à 7,8 ± 1,6 Å du site d’hydroxylation et devrait interagir avec un résidu cationique de la protéine distant de 4 ± 0,5 Å, selon un angle de 82 ± 15 °.

Site d’hydroxylation

du substrat Site anionique

du substrat Site cationique du CYP 2C9 7,8 ± 1,6 Å 4,0 ± 0,5 Å 82 ± 15 ° O O OH OH HO OH

Ce pharmacophore a ensuite été affiné grâce à l’étude RMN de l’interaction de cinq substrats avec le CYP2C9 (Poli-Scaife et al., 1997). Des distances fer-hydrogène déduites des temps de relaxation des protons ont permis d’améliorer le positionnement relatif des substrats. Deux motifs de reconnaissance ont alors été identifiés : une zone hydrophobe aromatique et une charge négative située à environ 8Å du site d’hydroxylation (cf. Figure 27).

Figure 27 : Superposition de six ligands du CYP2C9 (Acide tiénilique et deux dérivés, diclofénac, acide laurique, sulfaphénazole) d’après (Poli-Scaife et al., 1997).

Le sulfaphénazole, inhibiteur compétitif spécifique du CYP2C9, établirait trois interactions avec l’enzyme:

- une interaction électrostatique entre le groupe para-amino benzène sulfonamide de pKa = 6, anionique à pH physiologique (Bell and Roblin, 1942). et une charge positive de la protéine, située à environ 4 Å (Poli-Scaife et al., 1997).

- une interaction hydrophobe du groupe pyrazole-phényle avec un résidu hydrophobe de la protéine.

- une interaction NH2 - Fe, supplémentaire par rapport aux autres molécules reconnues Les deux premières interactions seraient communes à tous les ligands du CYP2C9. L’interaction supplémentaire NH2-fer été mise en évidence en spectroscopie UV-visible différentielle : l’addition de sulfaphénazole à des microsomes de levure exprimant le CYP2C9 induit l’apparition d’un spectre de type II (λmin = 390 nm, λmax = 425 nm). Ceci est caractéristique de la fixation du sulfaphénazole sur le fer par sa fonction NH2 (cf. I.B.1). Une distance azote - fer de 2,2 Å, a été mesurée par RMN (Poli-Scaife et al., 1997).

Figure 28 : Modèle d’interaction du sulfaphénazole avec le CYP2C9 d’après (Poli-

S N O O R3 N N R2 R1 Sulfaphénazole : R1 = NH2, R2 = phényle, R3 = H, Fe N O O S N- N N avec le fer Liaison de coordination Charge négative Zone hydrophobe 2.2 Å !

Zone hydrophobe aromatique

Sites anioniques des substrats

Site cationique du CYP2C9 Fer

Pour évaluer l’importance relative de chacune de ces trois interactions, une série de molécules dérivées du sulfaphénazole aux groupements R1, R2, R3 modifiés, a été synthétisée au laboratoire par Sylvie Dijols. Les modes d’interaction de ces molécules et leurs pouvoirs inhibiteurs (CI50) ont été étudiés par spectroscopie UV-visible différentielle, sur le CYP2C9 et sur les autres CYP2C humains afin de déterminer la spécificité de reconnaissance de chaque enzyme (Minoletti, 1998; Ha-Duong et al., 2001a et 2001b).

D’après les résultats obtenus, la complexation NH2-fer n’est pas responsable de la forte affinité du sulfaphénazole pour le CYP2C9. Les molécules à groupement R1 alkyle hydrophobe sont toujours bien reconnues par le CYP2C9 mais elles ne sont plus sélectives vis à vis cette isoforme (elles inhibent également le CYP 2C8). Par contre, deux autres interactions (liaison ionique et interaction π-π) semblent essentielles. La N-alkylation du sulfonamide par un groupement hydrophobe supprime l’interaction ionique avec le CYP2C9 et les molécules sont alors reconnues spécifiquement par le CYP 2C8 et CYP 2C18. Enfin, les dérivés à R3 cyclohexyle sont très mal reconnus par le CYP2C9. Une interaction purement hydrophobe n’est pas suffisante pour conserver une bonne affinité pour le CYP2C9. Le sulfaphénazole établirait donc une interaction de type π-π entre son groupement phényle et un résidu aromatique du CYP2C9.

Bilan : La superposition de bons ligands du CYP2C9 par modélisation moléculaire a mis en évidence plusieurs motifs structuraux communs à ces molécules. Ce pharmacophore comprend une zone hydrophobe aromatique et un site anionique ou donneur de liaisons hydrogènes. L’importance de l’interaction ionique pour la reconnaissance de ligands anioniques a été confirmée par des expériences menées au laboratoire sur des dérivés de l’acide tiénilique, du diclofénac et du sulfaphénazole (Figure 29).

R2 NH O C R Cl Cl NH Cl Cl O C S R3 N N N derivatives (4) Diclofenac derivatives (38) Sulfaphenazole derivatives (42) Tienilic acid Ar' Ar' Ar Ar Ar' Ar NH SO2 R2 R1 R1 SO2

Figure 29 : Etude des motifs chimiques importants pour la reconnaissance de l’acide tiénilique, du diclofénac et du sulfaphénazole par le CYP2C9. Le nombre de dérivés

synthétisés pour étudier les sélectivités relatives des CYP2C humains est indiqué entre parenthèses.

Modèles par homologie du CYP2C9

Des modèles par homologie du CYP2C9 (Jones et al., 1996; Jean et al.,1997; Jung et al., 1998; Lewis, 1998; Ha-Duong, 2001c, Payne et al., 1999a) ont été construits à partir d’alignements de séquences avec les cinq cytochromes P450 bactériens cristallisés à l’époque (P450cam, P450BM3, P450terp, P450eryF et P450nor). L’homologie de séquence entre CYP2C humains et P450 bactériens étant faible, ces modèles sont peu fiables : ils offrent une assez bonne représentation des blocs structuraux conservés, mais l’imprécision est forte sur les boucles très flexibles de la protéine.

Mutants et chimères du CYP2C9 (cf. alignement page suivante)

Plusieurs publications sur des mutants ou chimères du CYP2C9 figurent dans la littérature. Elles nous éclairent sur le rôle fonctionnel de certains résidus de l’hémoprotéine.

Il existe ainsi des « mutants naturels » du CYP2C9, correspondants à différents variants alléliques de l’enzyme: par exemple R144C (CYP2C9*2), I359L (CYP2C9*3) et D360G (CYP2C9*5). Ces mutations sont toutes caractérisées par une diminution d’efficacité catalytique: R144C induit une diminution des kcat alors que I359L et D360G provoquent une augmentation des Km du CYP2C9 pour différents substrats (Von Wachenfeldt and Johnson, 1995). Crespi et al. ont montré que le polymorphisme R144C affectait l’interaction avec la réductase, ce qui expliquerait les diminutions de kcat (Crespi and Miller, 1997). Dans les modèles de CYP2C9, les résidus Ile359 et Asp360 du SRS5 semblent trop éloignés de l’hème pour former un interaction directe avec les ligands. C. Von Wachanfeld et EF. Johnson suggèrent l’implication de Ile359 dans le positionnement de la boucle 362-368 par rapport à l’hélice I (Von Wachenfeldt and Johnson, 1995). Sa mutation modifierait la conformation du site actif et donc la reconnaissance des substrats par le CYP2C9.

Des mutants de CYP2C9 ont également été crées in vitro pour explorer la topologie du site actif de l’enzyme. Le positionnement de substrats dans les site actifs modèles du CYP2C9 permet d’identifier plusieurs acides aminés en interaction potentielle avec ces molécules. Ces prédictions doivent être vérifiées par des expériences de mutagenèse dirigée. Haining et al. ont ainsi montré l’implication de Phe114 et Val 113 dans des interactions hydrophobes avec la (S)-warfarine et le diclofénac (Haining et al., 1999). Phe114 serait l’acide aminé supposé interagir avec la zone hydrophobe aromatique du pharmacophore du CYP2C9. Enfin, malgré une forte homologie de séquence de 95,7%, les CYP2C9 et 2C19 ont chacun des substrats et des inhibiteurs très spécifiques. Afin d’ identifier les séquences responsables de ces différences de comportement, deux équipes américaines dirigées par JA. Goldstein et EF. Johnson ont choisi une stratégie indépendante des modèles de sites actifs, en construisant une série de chimères 2C9/2C19 (Jung et al., 1998; Klose et al., 1998). Ces études ont souligné l’importance de la région 227-283 incluant le SRS4 (région centrale de l’hélice I) dans la sélectivité du CYP2C9 envers le sulfaphénazole, le diclofénac et l’ibuprofène. Les acides aminés de cette zone, distincts chez les deux enzymes, ont été mutés. Les mutations de plusieurs chimères ont ainsi montré le rôle clé de deux résidus polaires du SRS4 : Ser286 et Asn289. D’après les modèles de CYP2C9, ces résidus ne seraient pas directement en contact avec les ligands du CYP2C9 mais auraient une influence sur le repliement du site actif et la sélection des substrats au niveau du canal d’accès de l’enzyme.

I.D.5 Intérêt de la structure RX du CYP2C5 de lapin pour l’étude topologique des