I. Etude fonctionnelle des composants du pilus de S pneumoniae
II.3. La structure des sortases formant le pilus se distinguent des structures de sortases classiques
Comme décrit précédemment, SrtC-1 et SrtC-3 possèdent une région, que l’on nomme couvercle, qui recouvre leur site actif et qui est absent chez les sortases de classes A et B dont les structures ont été résolues à ce jour. Ce couvercle aurait, potentiellement, deux fonctions : celle de maintenir les résidus du site actif, notamment l’arginine, dans une position appropriée pour la catalyse et celle de restreindre l’accès du site actif afin de ne sélectionner que les substrats adéquats.
Pour étayer cette hypothèse, nous avons comparé les structures de SrtC-1 et SrtC-3 avec la structure de SrtA de S. aureus complexée avec le peptide mimant le motif LPXTG. Il en résulte que, de façon intéressante, le couvercle prend une position similaire à celle du peptide LPETG (figure 51). Ce peptide, dans SrtA, est localisé dans une gorge allongée, à proximité des résidus Thr-180, Leu-181, Ile-182 et Thr-183 (en jaune sur la figure 51B). Ces résidus appartiennent à la séquence consensus TLXTC, motif hautement conservé parmi
Figure 50 : Site actif de SrtC-3. Les résidus Asp73 et Phe75 appartiennent au couvercle et l’ancrent dans le site actif où les résidus de la triade catalytique sont représentés en vert.
toutes les sortases et contenant la cystéine nucléophile. Il a été montré que cette région TLXTC joue un rôle dans la reconnaissance du substrat (Frankel et al., 2007). Nous pouvons donc supposer que cette région, qui est aussi présente dans SrtC-1 et SrtC-3, joue un rôle dans la reconnaissance du substrat pour ces deux enzymes. Cette région, comme le montre la figure 51A, est néanmoins recouverte par une partie du couvercle et est donc inaccessible dans cet état. Une ouverture du couvercle pourrait ainsi rendre accessible cette région ainsi que le site actif. La catalyse pourrait alors se faire. Ces observations suggèrent qu’un couvercle fermé (comme observé dans les structures) prévient potentiellement la reconnaissance de la séquence LPXTG du substrat, nécessitant alors un mécanisme d’ouverture du couvercle afin que la catalyse puisse se faire.
L’ouverture du couvercle pourrait être initié par une reconnaissance initiale entre le substrat (RrgB par exemple) et la sortase se trouvant en conformation fermée. Ainsi, seule une interaction avec le substrat approprié conduirait à l’ouverture du couvercle et à l’activation de l’enzyme. Ce modèle serait en accord avec celui proposé par Mandlik et ses collègues (Mandlik et al., 2008) dans lequel ils suggèrent que pour un assemblage approprié du pilus, deux types distincts de sortases doivent interagir séquentiellement : la (ou les) sortase(s)
Figure 51 : Conservation de la gorge de liaison au substrat. A/ Surface de SrtC-1. Les résidus du site actif sont en rouge. La région conservée TLXT précédant la cystéine nucléophile est montré en jaune. B/ Surface de SrtA de S. aureus dans laquelle les résidus du site actif et la région TLXT ont le code couleur cité précédemment. Le couvercle des sortases formant le pilus (en rose) est dans une position analogue au peptide LPETG (en vert) dans la structure de SrtA, suggérant que la gorge catalytique des sortases formant le pilus est physiquement bloquée par le couvercle.
formant le pilus et la sortase « housekeeping ». Cette dernière reconnaîtrait le lipide II en tant que substrat et ancrerait les pili sur le peptidoglycane. Afin qu’une bonne orchestration des étapes de polymérisation et d’attachement à la paroi soit possible, il est nécessaire que le sortases formant le pilus ne reconnaissent pas le lipide II, ni les protéines substrats de SrtA. Toutefois, le site actif de ce type de sortases est assez similaire à celui des sortases de classe A, hormis la présence du couvercle recouvrant le site actif chez les sortases impliquées dans la biogenèse du pilus. De ce fait, ce couvercle, qui pourrait seulement être ouvert par une sous-unité piline appropriée, garantirait que le lipide II ne soit pas reconnu. Toutefois, Lemieux et ses collègues ont montré que SrtA de S. pneumoniae n’était impliquée ni dans l’assemblage et ni dans l’ancrage du pilus sur le peptidoglycane, laissant supposer que les sortases de classe C du pneumocoque seraient également capables de lier les pili à la paroi bactérienne, et donc de reconnaître le lipide II en tant que substrat. Aucune étude additionnelle concernant le rôle de SrtA n’est encore disponible et, étant donné les controverses existantes quant aux rôles joués par les différentes sortases du pneumocoque, il serait intéressant de confirmer l’action de SrtA. Il faut également soulever qu’à la surface du pneumocoque plusieurs protéines, autres que les protéines Rrg du pilus, possèdent un motif LPXTG. Ces protéines sont destinées à être ancré sur le peptidoglycane. Une étude réalisée par Cécile Frolet du LIM montre que 15 protéines, excluant les trois protéines Rrg, chez la souche TIGR4 possèdent ce motif de reconnaissance des sortases. Ces protéines sont également présentes chez la souche R6, souche qui ne possèdent pas de pili. Ceci suggère ainsi que ces protéines sont ancrées au peptidoglycane par SrtA. Il est ainsi concevable de penser que ces protéines LPXTG ne doivent pas être reconnu par les sortases impliquées dans la biogenèse du pilus. La présence du couvercle sur ces dernières préviendrait ainsi la reconnaissance de ces protéines LPXTG.
En conclusion, le couvercle jouerait un rôle important pour l’activité sortasique et ne semblerait pas être simplement une région qui recouvre le site actif. De ce fait, le couvercle devrait être alors présent chez d’autres sortases de classe C. Comme aucune structure de celles-ci n’est disponible, après avoir recherché les sortases de diverses bactéries à Gram- positif ayant été étudiées et ayant un rôle dans la formation des pili, nous avons réalisé un alignement de séquences de ces différentes sortases afin de vérifier la présence du couvercle. Il semble ainsi que le couvercle, et notamment les deux résidus ancrant le couvercle dans le site actif (Asp-Trp/Phe/Tyr), soient conservés (figure 52).
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Figure 52 : Alignement de séquences de sortases formant le pilus. Séquences de S. pneumoniae, S. agalactiae, E.
faecalis, A. naeslundii, C. diphtheriae, S. pyogenes, B. cereus, et la sortase « housekeeping » SrtA de S. aureus
(dernière ligne). Un alignement de séquences a été effectué avec la séquence de SrtC-1 Les sortases formant le pilus possèdent un couvercle qui est absent chez les sortases non impliquées dans la biogenèse du pilus. La région correspondant au couvercle de SrtC-1 est représentée en pointillés magenta au-dessus des séquences. Les résidus conservés d’ancrage du couvercle (Asp - Pro/Ala - Trp/Tyr/Phe) sont sur fond magenta. Les résidus du site actif sont montrés en vert.