Microscopie électronique des fibres

Après purification des fibres sur gel filtration, celles-ci ont été également étudiées en microscopie électronique à coloration négative par le groupe de Guy Schoehn à l’IBS. Deux populations de fibres, avec deux diamètres différents, sont présentes (figure 36). La première, majoritaire, présente un diamètre de 3,5 nm environ. Le second type de fibres a un diamètre plus grand, d’approximativement 7 nm. Ces dernières semblent être potentiellement formées par l’association latérale de deux fibres plus fines (figure 36, d et g). De plus, les fibres observées sont « coudées », suggérant ainsi une certaine flexibilité de ces structures (figure 36, i et j).

Le poids moléculaire des fibres observées peut être approximativement calculé, comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Ainsi, le poids moléculaire de la plus grande fibre a été estimé à 480 kDa et celui de la plus petite à 140 kDa environ.

In vivo, les pili de S. pneumoniae ont été décrits comme des structures flexibles

formées par de fins protofilaments arrangés en une superstructure « coiled-coil » (Hilleringmann et al., 2008) (figure 37A). Ainsi, deux protofilaments de 3,5 nm de diamètre se croisent étroitement pour former des pili de diamètre 6,8 nm. Des zones, dans lesquelles

l’intersection entre les deux protofilaments est plus relachée, se retrouvent également sur le pilus produisant alors un diamètre de 9,5 nm (Hilleringmann et al., 2008) (figure 37B).

Par conséquent, les fibres que nous sommes capables de produire in vitro ont approximativement le même diamètre que les protofilaments de 3,5 nm et les filaments de 6,8 nm identifiés à la surface du pneumocoque.

L’assemblage formé in vitro, d’une longueur moyenne de 35 nm, est cependant plus petit que les pili visualisés in vivo qui ont une longueur de 500 µm à plus de 1 µm, comme le montre la figure 38. Il a été montré que les pili présents à la surface de diverses bactéries à Gram-positif possèdent des longueurs variables. Ainsi, des formes assez courtes de pili ont pu être identifiées chez S. salivarius, S. agalactiae, E. faecalis ou encore S. pneumoniae. Il est donc tout à fait possible que les structures que nous formons in vitro représentent ces « formes » minimales.

B

A

Figure 37 : Structure des pili de S. pneumoniae. A/ Modèle du pilus de S. pneumoniae. Deux protofilaments, composés de RrgB polymérisée, s’assemblent en une structure coiled-coil sur laquelle sont localisés les protéines RrgA et RrgC (Hilleringmann et al., 2008). B/ Images de cryomicroscopie électronique d’un pilus pneumococcique. Le diamètre du protofilament est de 3,5 nm, celui du pilus de 6.8 nm (et peut atteindre 9.5 nm de diamètre) (Hilleringmann et al., 2008).

Une autre hypothèse peut cependant être envisagée. Il est effectivement possible que les fibres formées in vitro soient courtes car SrtC-1 ne polymérise qu’inefficacement RrgB (ce qui est démontré par le nombre fini de bandes présentes sur gel SDS) et que cette enzyme a besoin d’autres composants du pilus pour former une fibre entière, telles que les autres sortases. Cette possibilité a été testée in vitro en incubant RrgB avec les trois sortases SrtC-1, SrtC-2 et SrtC-3 mais aucune différence n’a été observée. Par conséquent, la formation in vivo des pili doit probablement être un processus très bien orchestré qui requiert l’ensemble des composants impliqués dans la formation du pilus et associés à la membrane (aussi bien les sortases que les protéines Rrg) afin d’optimiser la reconnaissance des partenaires mais aussi la catalyse. Il est ainsi concevable qu’une telle organisation ne peut être reproduite in vitro, ce qui expliquerait la présence de courtes fibres dans notre cas.

Il est intéressant à noter que, pour la première fois, le rôle des sortases dans le processus de polymérisation du pilus a pu être mis en évidence in vitro en utilisant les protéines substrats.

Figure 38 : Le pneumocoque et ses pili. A/ Souche pneumococcique TIGR4 possédant des pili à sa surface observée par microscopie à force atomique (Falker et al., 2008). B/ Image de cryo-microscopie électronique de pili purifiés de la surface du pneumocoque. Les fléches ouvertes et fermées indiquent la présence de différentes tailles de pili (Hilleringmann et al., 2008).

A

B

II. Détermination de la structure des sortases

SrtC-1 et SrtC-3

Le traitement des jeux de données ainsi que la résolution des deux structures des sortases SrtC-1 et SrtC-3 ont été réalisés avec l’aide de Carlos Contreras-Martel. Les deux structures ont été déposés dans la PDB sous le code de 2W1J pour SrtC-1 et 2W1K pour SrtC-3 et ont été publiées dans Manzano et al., 2008.

II.1. Structure de SrtC-1

II.1.1. Production de SrtC-1

Seule la région du génome de S. pneumoniae TIGR4 codant pour les acides aminés 17 à 228 a été clonée (clonage réalisé par Anne-Marie Di-Guilmi). En effet, la partie N- terminale, assez hydrophobe, et la partie C-terminale, prédite comme un ancrage transmembranaire par le logiciel SMART (http://smart.embl-heidelberg.de), ont été délétées afin de s’affranchir d’éventuels problèmes de solubilité.

La protéine SrtC-1 est exprimée de façon recombinante chez E. coli et purifiée relativement facilement avec un rendement de bonne qualité (20 à 30 mg/L de culture).

II.1.2. Cristallogenèse de SrtC-1

Des premiers cristaux ont été obtenus avec le robot Cartésian de l’EMBL dans 0,1 M Tris pH 8,5, 0,2 M MgCl2 hexahydrate, 30% PEG4000. Ces cristaux, étaient trop petits pour

poursuivre des études de cristallographie aux rayons X. Ils ont été reproduits manuellement et apparaissent entre 48 et 72 heures dans le tampon cité précédemment (figure 39).

Figure 39 : Cristaux de SrtC-1 dans 0.1 M Tris pH 8.5, 0.2 M MgCl2 hexahydrate, 30%

Ces cristaux sont ensuite plongés successivement dans des solutions cryoprotectrices contenant une concentration croissante de glycérol (jusqu’à 15%) puis congelés par immersion dans l’azote liquide.