Structure et localisation de DMI2 (925 Acides Aminés) au niveau de la membrane plasmique des cellules (tête de flèche)

et de la membrane des cordons d’infection (flèche). B. Structure et localisation d’HMGR1 (550Acides Aminés) dans des vésicules de protoplastes chez A. thaliana. C. Structure et localisation de DMI1 (883 Acides Aminés) au niveau de l’enveloppe nucléaire des poils absorbants. D. Structure et localisation de DMI3 (523 Acides Aminés) dans les noyaux des poils absorbants. E. Structure et localisation d’IPD3 (513 Acides Aminés) dans les noyaux des poils absorbants. F. Structure et localisation nucléaire de NSP1 (554 Acides Aminés). Localisation de NSP2 (508 Acides Aminés) dans l’enveloppe nucléaire avant traitement aux facteurs Nod et relocalisation de NSP2 dans les noyaux des poils absorbants après ajout de facteurs Nod. G. Structure de NIN (933 Acides Aminés). H. Structure et localisation nucléaire d’ERN1 (268 Acides Aminés) dans des cellules de tabac.

LRRs et LHRI/II, Répétitions riches en leucine ; TM, domaine Transmembranaire ; NLS, Signal de localisation nucléaire ; CaMB, Domaine de liaison à la calmoduline ; EF, sites de liaison au calcium ; CC, domaine Coiled-Coiled d’interactions des protéines ; VHIID, PFYRE et SAW, motifs conservés des protéines GRAS ; RWP, domaine de liaison à l’ADN et de dimérisation ; PB1, domaine d’interactions protéines-protéines ; ERF, Domaine de liaison à l’ADN ; CMV, Motifs conservés du groupe V des facteurs de transcriptions ERF. Barres = 20 μm (A), = 10 μm (B à F), = 8 μm (H).

A : Endre et al., 2002 ; Limpens et al., 2005 ; B : Kevei et al., 2007 ; C : Peiter et al., 2007 ; Riely et al., 2007 ; D : Levy et al., 2004 ; Smit et al., 2005 ; E : Messinese et al., 2007 ; F : Smit et al., 2005 ; Kalo et al., 2005 ; G : Marsh et al., 2007 ; H : Middleton et al., 2007 ; Andriankaja et al., 2007.

C

B

D

E

F

G

H

Domaine Kinase CaMB EF EF EF

Domaine Visinin-like TM TM Domaine HMGR TM TM TM Domaine RCK TM NLS CC CC Ser/Thr Ser/Thr NLS

LHRI VHIID LHRIIPFYRE SAW Domaine GRAS CMV-4 CMV-3 ERF Domaines de fonction inconnue TM RWP PB1 I II III

semblent intervenir dans des étapes plus tardives de la nodulation, suggérant une action continue des facteurs Nod au cours de la nodulation.

DMI2 (Endre et al., 2002) et ses orthologues SYMRK (Stracke et al., 2002) chez L. japonicus et NORK chez M. sativa (Endre et al., 2002) codent pour un récepteur kinase (Figure 51A). DMI2, possède en outre, trois domaines LRR dans sa partie extracellulaire et un domaine de fonction inconnue. D’après les travaux de Hogg et al. (2006), le site de liaison aux facteurs Nod NFBS3 n’est pas détecté chez les mutants dmi1 et dmi2 alors qu’il est présent chez le mutant nfp. DMI2 pourrait donc participer à la formation d’un complexe récepteur participant de manière directe ou non à liaison aux facteurs Nod. Comme le prédit sa structure, DMI2 est localisée au niveau de la membrane plasmique des cellules mais aussi au niveau de la membrane des cordons d’infection (Limpens et al., 2005). DMI2 est exprimé dans les primordia nodulaires et la zone II des nodules indéterminés (Figure 52) (Bersoult et al., 2005). Un rôle dans la préparation et le contrôle de l’infection a donc été suggéré. Les récentes études de Limpens et al. (2005) et Capoen et al. (2005) confirment cette hypothèse en montrant l’implication de DMI2 dans la libération des bactéries. Très récemment, une protéine interagissant avec le domaine kinase de DMI2 a été identifiée : il s’agit de l’enzyme HMGR1 (3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase 1) (Figure 51B). L’expression tissulaire de HMGR1 est associée avec celle de DMI2 dans l’épiderme racinaire de la zone de nodulation et localisée au niveau subcellulaire dans des vésicules issues du réticulum endoplasmique (dans des protoplastes d’A. thaliana). L’utilisation de constructions RNAi- HMGR1 a mis en évidence le rôle essentiel d’HMGR1 dans l’initiation des nodules. Les protéines HMGR constituent l’étape limitante de la voie de l’acide mévalonique conduisant à la synthèse des isoprénoides à l’origine des cytokinines et des phytostéroïdes. Selon les auteurs, HMGR1 pourrait donc intervenir dans la synthèse des cytokinines et jouer un rôle dans la stimulation des divisions corticales ou dans la synthèse des stéroïdes et intervenir lors de l’endocytose des bactéries, ou encore dans la transduction d’un signal (Kevei et al., 2007).

Alors que les récepteurs potentiels sont placés au niveau de la membrane plasmique, les oscillations calciques, essentielles à la nodulation sont observées au niveau du noyau des cellules. Un second messager interviendrait donc probablement entre les récepteurs et les producteurs d’oscillations calciques nucléaires. D’après des analyses pharmacologiques (utilisation du mastoparan, un agoniste des protéines G) des protéines G interviendraient en réponse aux facteurs Nod et activeraient des phospholipases C et D, qui pourraient être à l’origine de ce second messager (Pingret et al., 1998 ; Charron et al., 2004). Ce second messager agirait en aval de NFP et DMI2 (Sun et al., 2007) et en amont de DMI1 (Peiter et

Figure 52. Localisation de l’expression des gènes impliqués dans la transduction du signal facteurs Nod dans la zone d’infection des nodules

Les gènes NFP, LYK3, DMI1, DMI2 et DMI3 sont tous exprimés dans la zone d’infection des nodules matures chez M. truncatula.

al., 2007). Aucun mutant de composants de la signalisation des protéines G n’a été caractérisé, par contre, certains de ces composants sont induits en réponse aux Rhizobia (El Yahyaoui et al., 2004 ; Mitra et al., 2004a).

NUP133 (Kanamori et al., 2006) et NUP85 (Saito et al., 2007) codent pour des nucléoporines. Chez les vertébrés, ces nucléoporines appartiennent à un même complexe formant un pore nucléaire spécifique. La localisation de NUP133 de manière ponctuelle au niveau de l’enveloppe nucléaire, suggère que cette protéine interviendrait aussi dans la formation d’un pore nucléaire chez les Légumineuses qui pourrait être impliqué notamment dans le passage d’un second messager.

DMI1 (Ane et al., 2004) et son orthologue POLLUX (ainsi qu’un homologue de POLLUX, CASTOR) (Imaizumi-Anraku et al., 2005) codent pour une protéine nouvelle possédant des domaines transmembranaires et présentant une faible homologie avec les canaux ioniques des archéobactéries (domaine RCK) (Figure 51C). Cette homologie suggère un rôle possible de DMI1 au niveau des flux ioniques observés en réponse aux facteurs Nod (altérés chez le mutant dmi1). Alors que la localisation des protéines CASTOR et POLLUX a été décrite dans les plastes (Imaizumi-Anraku et al., 2005), DMI1 a récemment été localisée au niveau de l’enveloppe nucléaire (Riely et al., 2007) remettant en cause la localisation de CASTOR et POLLUX dans les plastes. D’après des études récentes, DMI1 ne serait pas directement impliquée dans les changements calciques induits par les facteurs Nod (Sun et al., 2007), mais aurait la capacité de réguler l’activité des canaux calciques (Peiter et al., 2007). Ces travaux vont dans le même sens que ceux de Parniske et al. (XIIIème Conférence MPMI, Sorrento, Italie, 2007) qui suggèrent que CASTOR et POLLUX seraient des canaux potassiques, jouant un rôle de moteur des oscillations calciques. DMI1, potentiellement activée par un second messager, pourrait donc être responsable de l’activation des canaux calciques à l’origine des mouvements calciques périnucléaires. Le stock de calcium de l’enveloppe nucléaire serait renouvelé via des pompes calciques (Oldroyd et Downie, 2006). Enfin, dans les nodules, DMI1 est exprimé dans la zone II, où les bactéries sont libérées et les facteurs Nod internalisés (Figure 52) (Limpens et al., 2005).

DMI3 (Levy et al., 2004 ; Mitra et al., 2004b) et son orthologue LjCCaMK (Tirichine et al., 2006b) codent pour une protéine kinase calcium et calmoduline dépendante (CCaMK). Cette protéine possède en position N-terminale un domaine sérine/thréonine kinase puis un domaine de liaison à la calmoduline qui chevauche un domaine auto-inhibiteur et dans sa partie C-terminale un domaine de liaison au calcium constitué de trois motifs EF (Figure 51D). Gleason et al. (2006) ont montré que la régulation de l’activité kinase de DMI3 par le

Figure 53. Induction d’ENOD11 et formation de nodules spontanés par une forme auto-active de DMI3 A. Structure de la protéine DMI3. DMI3 est constituée d’un domaine kinase (gris), d’un domaine auto-

inhibiteur chevauchant un domaine de liaison à la calmoduline (noir) et de motifs EF de liaison au calcium (blanc). Les constructions DMI3326 et DMI3311 constituent des formes auto-actives de DMI3. B. Nodulation spontanée observée sur des racines du mutant dmi3-1 transformées avec DMI3311. C. Expression constitutive de la noduline ENOD11 (visualisée en bleu) au niveau de l’épiderme des racines de dmi3-1 transformées avec DMI3326. D. Racines de dmi3-1 transformées avec une construction 35S-DMI3. Seule l’expression constitutive d’ENOD11 dans la coiffe racinaire est visible avant traitement aux facteurs Nod. Après traitement aux facteurs Nod (1 nM), l’expression d’ENOD11 est induite dans l’épiderme (E). F-I. Expression constitutive de la noduline ENOD11 dans les racines de dmi2-1 (F), dmi1-2 (G), nsp1-1 (H) et nsp2-1 (I) transformées avec DMI3326. La forme auto-active de DMI3 entraîne une expression constitutive forte d’ENOD11 chez les mutants dmi1 et dmi2. Une faible expression d’ENOD11 est détectée chez le mutant nsp1 et aucune expression dans l’épiderme n’est détectée chez le mutant nsp2. J. Racines du mutant ern1 transformées avec DMI3311. Aucun nodule spontané n’est formé.

A, C-I : Gleason et al., 2006 ; B, J : Middleton et al., 2007.

C

D

F

H

G

E

I

J

calcium est identique à celle mise en évidence pour la CCaMK du lys. DMI3 a la possibilité de lier le calcium sous deux formes : des ions calciques libres qui se lient directement aux domaines EF et des ions calciques complexés avec la calmoduline. Dans un premier temps, la liaison du calcium aux motifs EF induit l’autophosphorylation de la protéine, ce qui augmente son affinité pour la calmoduline. Dans un deuxième temps, la CCaMK se lie au complexe calcium-calmoduline, supprimant l’effet du domaine auto-inhibiteur et activant ainsi le domaine kinase. Les capacités de liaison du calcium de DMI3 associées à sa localisation nucléaire (Smit et al., 2005 ; Kalo et al., 2005) en font un bon candidat pour traduire le message complexe porté pas les oscillations calciques en une réponse physiologique via la phosphorylation de protéines cibles. Cette hypothèse est renforcée par les travaux récents menées par Gleason et al. (2006) et Tirichine et al. (2006a) chez M. truncatula et L. japonicus. Ils ont mis en évidence que la suppression du domaine auto-inhibiteur, l’expression du seul domaine kinase ou une mutation ponctuelle dans le domaine d’autophosphorylation, conduisent tous à des formes « actives » de DMI3, induisant une nodulation spontanée (Figure 53A-B). L’activité constitutive de DMI3 permet donc d’activer la voie de signalisation conduisant à l’organogénèse nodulaire. Cette forme active de DMI3/CCaMK exprimée chez les mutants dmi2 et dmi1 (Gleason et al., 2006), nfr1 et nfr5 (Tirichine et al., 2006b), entraîne une réponse de type symbiotique alors que ce n’est pas le cas chez les mutants nsp2-1 (Gleason et al., 2006), nin (Marsh et al., 2007) et ern1/bit1 (Middleton et al., 2007) (Figure 53C-J). Ces résultats confirment le rôle critique joué par DMI3 dans la transduction du signal calcique en aval des récepteurs aux facteurs Nod et de DMI1 et en amont des protéines régulatrices NSP, NIN et ERN. Enfin, l’expression de la forme active de DMI3 chez un mutant hcl entraine la formation de nodules spontanés, confirmant l’hypothèse que le gène LYK3 ne serait pas lié à l’organogénèse nodulaire (Marsh et al., 2007) (Figure 54A-B). Récemment, une protéine interagissant avec DMI3 a été mise en évidence chez M. truncatula. Cette protéine, IPD3 (Interacting Protein of DMI3) est localisée dans le noyau et interagirait avec DMI3 via ses domaines Coiled-Coiled (Figure 51E). Des études de phosphorylation d’IPD3 par DMI3 sont en cours pour déterminer le rôle d’IPD3 dans la transduction du signal calcique (Messinese et al., 2007). Enfin, comme les autres gènes impliqués dans la transduction du signal facteur Nod (NFP, DMI1, et DMI2) DMI3 est exprimé dans la zone II des nodules (Figure 52) (Limpens et al., 2005), alors qu’IPD3 est exprimé dans la zone de fixation des nodules (Messinese et al., 2007).

MtNSP1 (Smit et al., 2005) et MtNSP2 (Kalo et al., 2005) et leurs orthologues LjNSP1 (Heckmann et al., 2006) et LjNSP2 (Murakami et al., 2007) codent pour des protéines

Figure 54. Le gène NIN est impliqué dans l’organogénèse nodulaire et la régulation de la noduline ENOD11

A-C. MtNIN est requis pour l’organogénèse nodulaire induite par la forme active de DMI3 chez M. truncatula.