La structure de COX-1 et COX-2

Les enzymes COX-1 et COX-2 sont des protéines homodimériques. Chaque monomère mesure 70 kDa et contient les deux sites actifs COX et POX. COX-1 et COX-2 partagent 60% d’identité de séquence et comportent 602 et 604 acides aminés respectivement. Une différence singulière est à noter : 17 acides aminés de l’extrémité N-terminale de COX-1 sont absents chez la COX-2 et la COX-2 présente 18 acides aminés sur l’extrémité C-terminale qui ne se retrouvent pas dans la COX-1 [16, 42].

L’élucidation de leur structure tridimensionnelle (en 1994 pour COX-1 [47] et en 1996 pour COX-2 [20]) a permis de révéler trois unités indépendantes mais identiques chez les deux protéines: un domaine EGF-like N-terminal, un domaine hélicoïdal de liaison à la membrane (MBD) composé de 4 hélices α (A-D) situé près des couches lipidiques, et un très grand domaine globulaire à l’extrémité C-terminale (Figure 5). Ce dernier domaine est le plus important puisqu’il contient les sites actifs COX et POX. Ces deux sites sont localisés sur des côtés opposés du domaine catalytique [35, 41-43, 48-51]. Les substrats et les inhibiteurs accèdent au site actif COX en passant d’abord à la base du MBD [20], puis traversent un long

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tunnel hydrophobique (25 Å de longueur, et 8 Å de largeur) pour atteindre l’intérieur du domaine catalytique [20, 22, 35] où est localisé le site actif COX [52].

Ce long tunnel hydrophobique présente une zone de compression à l’interface entre le MBD et le site actif COX. Cette zone est constituée de trois acides aminés, Arg 120, Glu 524 et Tyr 355 qui établissent un véritable réseau de liaisons hydrogène. L’alternance entre le maintien et la rupture de ce réseau de liaisons hydrogène joue le rôle d’ouverture et de fermeture au site actif. Cette zone participe également à l’inhibition dite « time-dependent » de tous les inhibiteurs.

(a) (b)

Figure 5 : a) Représentation de COX-1 avec le flurbiprofène (jaune), précisant les positions des sites POX , contenant l’hème (rouge), et COX et le domaine catalytique (bleu), le MBD (orange) et le domaine EGF-like (vert) [52]

b) Représentation de COX-2 avec l’inhibiteur RS 104897 (vert), l’hème (marron), le domaine catalytique (bleu), le MBD (violet) et le domaine EGF-like (jaune) [20]

Les sites actifs de la COX-1 et de la COX-2 présentent des structures tridimensionnelles très similaires et parmi les acides aminés conservés entre les 2 isoformes, certains se révèlent être essentiels : l’Arg 120 (située à l’entrée du site et intervenant dans la liaison des anti-inflammatoires non-stéroidiens (AINS) et de l’AA), la Tyr 385 (qui intervient dans la réaction de cyclooxygénation) et la Ser 530 (qui établit une liaison covalente notamment avec l’aspirine lors de la réaction d’acétylation).

Quelques différences majeures entre les sites actifs de la COX-1 et de la COX-2 sont cependant à noter expliquant la spécificité de certains inhibiteurs pour chacune de ces deux protéines.

Premièrement, les sites actifs de COX-1 et COX-2 ont des formes et tailles différentes. Le site actif de COX-2 est plus large de plus de 17% que COX-1, permettant l’introduction de

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diverses molécules plus volumineuses qui ne pourront pas s’insérer dans le site actif de COX-1. De plus, la COX-2 possède une seconde poche interne augmentant de 25% le volume de son site actif (Figure 6).

Figure 6 : Les résidus esssentiels constituant les sites actifs de COX-1 et COX-2. Les substitutions Arg 513, Val 523, Leu 503 et Val 434 (non représentée) dans COX-2 permettent un gain de 25% du volume dans le site actif de COX-2 [53]

Les principaux acides aminés expliquant la taille et l’environnement chimique différents dans le site de liaison se trouvent :

-en position 523, une isoleucine dans COX-1, est remplacée par une valine dans COX-2 (Figure 6 et Figure 7). Ce résidu plus petit libère de la place dans le tunnel hydrophobique et facilite l’accès à la seconde poche supplémentaire. Cette poche est particulièrement connue pour être le site de liaison des inhibiteurs sélectifs de 2. Quant à l’isoleucine dans COX-1, son groupe éthyle encombre le passage de molécules plus volumineuses [2COX-1, 35, 54].

-en position 434, une autre isoleucine est remplacée par une valine dans COX-2 (Figure 7).Cette fois-ci, cette substitution offre une meilleure mobilité des chaînes latérales des résidus, c’est le cas notamment de Phe 518 qui en pivotant réduit les effets stériques et améliore l’accès à la seconde poche [39].

-en position 513 ; une histidine est remplacée par une arginine dans COX-2 (Figure 6 et Figure 7). Ce résidu a montré de meilleures affinités avec les groupements sulfonamides des inhibiteurs sélectifs de COX-2 favorisant non seulement la formation de liaisons hydrogène mais aussi l’introduction de ces molécules dans le second site de liaison. L’Arg 513 joue

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également un rôle important dans les inhibitions dites « time-dependent », pour les inhibiteurs sélectifs de COX-2 [21, 35, 54].

-en position 503, une phénylalanine est substituée par une leucine dans COX-2 (Figure 6). Ce résidue pivote sa chaîne latérale de façon à augmenter l’espace à l’intérieur du site actif pour permettre un accès facile aux molécules sélectives et volumineuses dans la poche supplémentaire [21, 35, 54].

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Figure 7 : Differences des sites de liaisons des COX : Val434, Arg513, et Val523 forment la poche supplémentaire de COX-2 qui est absent dans COX-1. A : Un inhibiteur non sélectif accède au site actif des deux isoformes. B : Seuls les inhibiteurs sélectifs réussissent à pénétrer dans le site actif de COX-2, dans COX-1, les résidus volumineux (Ile434, His513 et Ile 532) empêchent l’accès au site actif [55]

De plus, l’hélice D contenue dans le domaine MBD adopte une position différente dans COX-2 permettant à l’Arg 1COX-20 de pivoter. Ce mouvement participe également à un gain d’espace au sein du site actif [35].

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La COX-2 présente aussi un deuxième réseau de liaisons hydrogène, formé au dessus de la zone appelée « lobby » [35], cette fois entre l’Arg 513, le Glu 524, et la Tyr 355 [35], et démontrant une nouvelle fois, la flexibilité de la protéine. En effet l’établissement de ce deuxième réseau de liaisons hydrogène dans COX-2 implique un changement de conformation de la protéine expliquant ainsi sa flexibilité conformationnelle [20, 21, 33, 35, 39, 48, 56-58]. Le lobby est une zone située au dessous de la MBD, et est constituée de résidus tels que Pro 86, Ile 89, Leu 93 et Val 116. Certains inhibiteurs sont capables de se lier dans cette zone [35].

Tous ces changements rendent le site actif de COX-2 plus grand et beaucoup plus flexible que celui de COX-1, flexibilité qui est surtout perçue au niveau de sa voûte apicale expliquant ainsi les nombreuses conformations adoptées par COX-2. La surface accessible aux molécules d’eau est aussi plus importante, permettant des interactions essentielles ligand-protéine [39].