Stratégies existantes pour générer le peptide thioester sur support solide

Les peptides thioester sont facilement préparés et avec de bons rendements par synthèse peptidique en phase solide (SPPS) en stratégie Boc (tert-butoxycarbonyle) par

90

introduction d’un lien thioester entre le peptide et la résine.¹²⁹ En fin d’élongation, le clivage du peptide de la résine et sa déprotection sont effectués dans les conditions standard de la chimie peptidique Boc, par traitement au HF. Un équipement spécialisé est requis pour le traitement par le HF en raison de sa forte toxicité et de sa nature corrosive. Du fait de la dangerosité du HF, et parce que son utilisation n’est pas compatible avec la synthèse de fragments peptidiques comportant certaines modifications (en particulier certaines modifications post-traductionnelles), de nombreuses recherches portent actuellement sur le développement de méthodes de synthèse de peptides thioester en stratégie Fmoc (9-fluorénylméthoxycarbonyle).¹³² Il est à noter que l’utilisation d’un lien thioester entre le peptide et la résine n’est pas envisageable en stratégie Fmoc car ce lien est sensible au traitement par la pipéridine utilisé pour éliminer le groupement protecteur Fmoc.

Le laboratoire des Biomolécules est équipé pour l’utilisation du HF et la synthèse de nos CPP cibles est totalement compatible avec l’utilisation de ce réactif. Ainsi, au cours de ma thèse, j’ai principalement utilisé la stratégie Boc pour synthétiser les peptides thioester qui ont ensuite été cyclisés par NCL. Cependant, pour pouvoir proposer une stratégie synthétique plus générale, je me suis également intéressé à la synthèse de peptides thioester en stratégie Fmoc.

Diverses approches ont été proposées dans la littérature pour contourner le problème d’instabilité du lien thioester vis-à-vis des conditions standard de la Fmoc-SPPS. Elles reposent principalement sur des stratégies qui permettent de transformer une liaison stable vis-à-vis des conditions utilisées en chimie Fmoc en une fonction thioester, correspondant soit à l’utilisation d’un lien « safety-catch » soit à la mise en jeu d’un réarrangement intramoléculaire par transfert d’acyle O→S ou N→S. Quelques exemples significatifs sont présentés ci-dessous.

Le groupe de A. Pessi a été le premier à proposer l'utilisation d’un lien ‘safety-catch’ (ou cran de sécurité) en exploitant le lien sulfamylbutyryl développé dans les années 70 par G. W. Kenner et R. Sheppard (Figure 52).^133,134 Ce lien, stable vis-à-vis de la pipéridine, peut être activé par alkylation en fin d’élongation du peptide, devenant alors sensible à l’attaque par un nucléophile. Le dernier aminoacide couplé doit être protégé par un groupement Boc

91

avant alkylation. Ainsi, le traitement du peptide-résine par du sodium thiophénolate conduit au peptide thioester protégé. Les chaînes latérales sont ensuite déprotégées en solution. Cette méthode a permis la synthèse de nombreuses protéines cibles, y compris des protéines avec modifications post-traductionnelles. Il faut cependant signaler que l’étape de thiolyse sur support solide est peu efficace du fait de la faible solvatation du peptide-résine. Cependant, il a récemment été montré que cette étape de thiolyse sur support solide n’est pas nécessaire et que les peptides N-méthylsulfonamide déprotégés, faciles d’accès, peuvent être utilisés directement dans la réaction de ligation chimique native. L’espèce thioester est formée in situ en présence du thiol MPAA.¹³⁵

Figure 52 – Utilisation du lien sulfamylbutyryl pour générer un peptide thioester en stratégie Fmoc proposée par l’équipe de A. Pessi. PG = protection des chaînes latérales. (Source : d’après Réf. ¹³⁴)

Une autre approche a été décrite par J. B. Blanco-Canosa et P. E. Dawson et utilise le lien safety-catch 3,diaminobenzyle. Après assemblage du peptide, un traitement par le 4-nitrophénylchloroformiate induit, après réarrangement, la formation de N-acylbenzimidazolone (Nbz).¹³⁶ Le peptide-Nbz peut être clivé de la résine en condition acide (100 % TFA) sans toucher à l’intégrité de la fonction Nbz. En conditions douces, dans un tampon aqueux neutre, l’addition de thiol permet la thiolyse du peptide N-acylurée. Le thioester peut aussi être généré in situ dans les conditions de ligation chimique native (Figure 53).

92

Figure 53 – Synthèse du peptide thioester grâce au lien acylurée Nbz. (Source : Réf. ¹³⁶)

P. Botti et ses collaborateurs ont été les premiers à proposer une méthode reposant sur un réarrangement par transacylation. Il s’agissait dans leur cas d’un transfert d’acyle d’un oxygène sur un soufre (O→S).¹³⁷ La résine est tout d'abord fonctionnalisée par une cystéine protégée sur sa chaîne latérale par un groupement S-tert-butyle (Figure 54). Après oxydation de l’amine α, le peptide est synthétisé en stratégie Fmoc-SPPS. Le clivage de la résine en condition acide, permet l’accès à un fragment peptidique carboxyethylester. Dans les conditions de ligation à pH neutre, l’addition de thiophénol, permet la déprotection du thiol de la cystéine et le déclanchement d’un réarrangement intramoléculaire via une O→S transacylation conduisant à la formation de la fonction thioester. Les auteurs ont ainsi pu synthétiser une protéine mais mentionnent que cette méthode peut conduire à une réaction secondaire d’hydrolyse.

Figure 54 – Formation de peptides thioester par O→S transacylation. PG = protection des chaînes latérales.

93

Par la suite, d’autres groupes de recherche ont utilisé des approches basées sur le transfert d’acyle N→S. Ainsi, H. Hojo et ses collaborateurs ont montré que la fonction thioester peut être générée en présence d’acide 3-mercaptopropionique (MPA) à partir de peptides contenant en leur extrémité C-terminale une N-alkyl cystéine (Figure 55).¹³⁸ Ceci implique l’attaque nucléophile du groupement thiol de la Cys sur l’amide substituée adjacente. L’amine secondaire libérée étant encombrée et moins nucléophile que le thiol, l’équilibre entre les formes amide et thioester est déplacé vers la formation du thioester. Celui-ci est ensuite piégé par réaction avec le MPA (étape irréversible). D. Macmillan et son groupe ont également montré que le chauffage (à 60°C) de peptides contenant un motif Xaa-Cys dans leur séquence (avec Xaa = Gly, His ou Cys) à pH acide et en présence de thiol, conduit à une thiolyse au niveau de ce motif.¹³⁹ Bien que la conversion en thioester ne soit pas quantitative, des peptides thioester peuvent être obtenus de cette façon à partir de peptides contenant une Cys C-terminale. Cette méthode est cependant limitée à l’accès de fragments thioester ayant une Gly, His ou Cys terminale.

Figure 55 – Formation de la fonction thioester par transfert d’acyle N→S à partir d’un peptide porteur d’une cystéine ou N-alkyl cystéine C-terminale. Me = méthyle, Et = éthyle, iBu = isobutyle, Bn = benzyle, MPA = acide S-trityl-mercaptopropionique(Source : Réf.¹⁴⁰)

L’utilisation des liens bis(sulfanylethyl)amido (SEA)¹⁴¹ (Figure 56) et sulfanylethylanilide,¹⁴² sont également des exemples intéressants basés sur le même principe de transfert d’acyle N→S et ayant permis la synthèse de cibles protéiques difficiles.

MPA

94

Figure 56 – Ligation chimique native entre un fragment contenant un groupement SEA en

position C-terminale et un deuxième fragment peptidique contenant une cystéine en extrémité N-terminale. (Source : Réf. ¹⁴¹)

Ces deux liens, ainsi que les liens de type N-alkyl cystéine, sont cependant difficiles à acyler pour le couplage du premier acide aminé C-terminal. Récemment, le groupe de J. Offer en collaboration avec F. Burlina ont montré que des peptides comportant en leur extrémité C-terminale un résidu α-méthyle cystéine peuvent être utilisés directement dans la réaction de NCL, le thioester étant produit in situ en présence de thiol. La conversion en thioester et la ligation qui s’en suit sont totales. Le couplage de l’α-méthyle cystéine sur la résine et le couplage du résidu suivant sont réalisés dans des conditions standard et avec de bons rendements.¹⁴³ J’ai également utilisé ce type de dérivés pour la synthèse de CPP cycliques.

95

III – DEVELOPPEMENT DE

NOUVEAUX PEPTIDES VECTEURS