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V. Conclusions et perspectives
Au début de ce projet de thèse, la cyclisation des CPP était encore très peu explorée. Uniquement deux articles avaient été publiés en 2011 traitant de CPP cycliques purement peptidiques.113,114 Cette nouvelle classe de vecteurs, ayant une stabilité métabolique accrue, suscite cependant de plus en plus d’intérêt, à en juger par la littérature récente. L’objectif de mon travail a donc été d’apporter des premiers éléments de réponse quant à l’internalisation des peptides vecteurs cycliques et l’impact de leur fonctionnalisation par une chaîne d’acide gras. Nous souhaitions évaluer l’effet de ces modifications structurales sur les mécanismes d’entrée dans les cellules et l’interaction avec les GAG qui constituent des partenaires clés des CPP dans le processus d’internalisation, l’objectif final étant de concevoir des CPP plus efficaces. Ce travail a permis la préparation et l’évaluation d’une quinzaine de nouveaux composés qui se sont, pour la plupart, révélés plus efficaces que les CPP classiques pour la vectorisation d’une cargaison peptidique.
Dans un premier temps, mon travail a porté sur la synthèse en stratégie Boc de peptides thioester, fonctionnalisés en leur extrémité N-terminale par une cystéine, nécessaire pour la réaction de cyclisation par ligation chimique native. L’optimisation des conditions expérimentales de cyclisation des thioester préformés a permis l’obtention de vecteurs cycliques de nature purement peptidique ou lipopeptidique. La ligation chimique native s’est révélée tout à fait adaptée à la préparation de notre série de composés. En parallèle, une autre méthode a été mise au point pour la synthèse de peptides cycliques, reposant sur l’utilisation de précurseurs de thioester (peptides α-MeCys) obtenus cette fois-ci en stratégie Fmoc. L’évaluation de l’effet de la cyclisation sur les propriétés de transport de ces nouveaux vecteurs a été réalisée par le suivi d’une cargaison peptidique (le PKCi), qui seule ne s’internalise pas, et qui leur a été liée de manière covalente via un lien disulfure. La quantification du peptide PKCi intact se trouvant dans le milieu intracellulaire a été réalisée par spectrométrie de masse MALDI-TOF.
Les résultats indiquent une meilleure internalisation, essentiellement par voie d’endocytose, suite à la cyclisation des CPP R9, Tat, R6W3 et Pen. C. Cardoso avait montré précédemment que Tat cyclique (non conjugué à une cargaison) pénètre mieux par
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translocation directe que la version linéaire.114 Nous n’avons pas observé cet effet sur [Tat] conjugué au PKCi. Notre étude a également montré que dans cette série, l’entrée des peptides cycliques est plus dépendante des GAG de surface que celle des peptides linéaires correspondants, suggérant une interaction ou recrutement plus efficace des GAG. Par la suite, la cyclisation combinée a l’acylation par une chaîne lauryl a permis d’augmenter le potentiel de vectorisation de Pen et R9 d’un facteur cinq et huit, respectivement. Ce résultat, fait de [C12-Pen] le peptide le plus efficace que nous ayons testé durant ce projet pour l’internalisation du PKCi. Ceci s’accompagne malheureusement d’un effet cytotoxique pour [C12-Pen] et dans une moindre mesure pour [C12-R9], ce qui limite leur utilisation.
Ces résultats prometteurs nous ont conduit à concevoir une petite libraire de dix CPP amphiphiles constitués d’un domaine oligo-arginine cyclique de taille variable fonctionnalisé par une chaîne lipidique. L’étude de ces différents transporteurs a permis d’identifier certains paramètres structuraux influençant leurs propriétés d’internalisation. [C12-R4] est internalisé plus efficacement que son analogue linéaire du fait d’une meilleure interaction avec les GAG de surface. L’augmentation du nombre de résidus arginine au sein du cycle (de 4 à 7) conduit à une baisse significative de la quantité de PKCi transportée via endocytose mais accroit les propriétés de translocation du vecteur (comparaison des CPP [C12-R4] et [C12 -R7]). La position de la chaîne lauryl au sein de la séquence peptidique joue aussi un rôle crucial dans le mécanisme d’entrée. Les vecteurs [C12-R4] et [R2-C12-R2], pour lesquels les 4 résidus Arg sont soit adjacents soit groupés par paires, permettent une accumulation de la cargaison dans les cellules à une concentration de l’ordre de 8 µM, 3 fois supérieure à la concentration obtenue avec le CPP [R3-C12-R] adoptant une distribution des résidus Arg « 3+1 ». Ceci résulte essentiellement d’une endocytose (et interaction avec les GAG) plus efficace.
De toute la série de peptides testés dans ce projet (20 CPP au total), deux séquences nous semblent fortement intéressantes par leur capacité assez remarquable à franchir les membranes cellulaires, leur caractère non toxique et leur facilité de synthèse. Il s’agit, d’une part, du CPP [C12-R4] qui conduit à une concentration intracellulaire de cargaison peptidique intacte de 8 µM environ. L’internalisation de ce conjugué est cependant majoritairement dépendante de l’endocytose (environ 85 %). Le CPP [C12-R7] permet quant à lui une
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translocation directe plus efficace (2 µM de PKCi intracellulaire mesuré lors d’une incubation à 4°C), conduisant à un accès direct dans le cytosol des cellules.
L’augmentation du potentiel d’internalisation d’une séquence donnée par cyclisation et acylation par une chaîne lauryl a été montrée au cours de ce travail. Il serait intéressant maintenant d’optimiser les deux CPP prometteurs que nous avons identifiés par introduction de nouvelles modifications. La première modification qui peut être envisagée et qui est simple à réaliser consiste à incorporer des aminoacides de configuration D. Le groupe de Pei utilise une alternance d’aminoacides de configuration L et D dans ses séquences cycliques, ce qui semble améliorer l’efficacité d’entrée.117 L’équipe de Cardoso a par contre utilisé le peptique [Tat] entièrement composé d’acides aminés D.114 Par ailleurs, il a récemment été montré dans le laboratoire que l’acylation du peptide Arg4 linéaire par une chaîne lipidique comportant des insaturations de configuration cis permet de favoriser l’entrée par translocation directe.156 Ainsi, la combinaison d’une chaîne d’acide gras insaturée et d’une structure peptidique cyclique pourrait s’avérer très intéressante.
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