Cyclisation des peptides thioester par ligation chimique native

Dès le premier CPP-MPAL synthétisé (R6W3-MPAL), des réactions de cyclisation ont été réalisées afin de définir les paramètres importants pour la réaction de ligation et de l’optimiser. La réaction est suivie par HPLC en phase inverse. Le mécanisme de cyclisation par NCL est représenté sur la Figure 59.

Figure 59 – mécanisme de cyclisation des CPP-MPAL via ligation chimique native (NCL)

classique (à partir d’un thioester préformé).

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Les réactions de cyclisation se font en solution aqueuse dans un tampon phosphate à pH neutre, en présence d’un additif thiol (le MPAA, Figure 59) et d’un agent réducteur (le TCEP) et éventuellement d’un agent dénaturant, le chlorhydrate de guanidine. Bien que le tampon soit soigneusement dégazé et purgé à l’argon avant mise en solution du peptide, l’addition de TCEP est nécessaire pour maintenir les thiols (cystéine et MPAA) sous forme réduite. Il n’est en revanche pas nécessaire de conserver le mélange sous argon pendant la réaction.

Facteurs influençant la cinétique de la réaction :

- Le pH

Les réactions de ligation chimique native sont classiquement effectuées à un pH proche de la neutralité (pH 6,5 à 7,5). La réaction est accélérée lorsque le pH est augmenté du fait de la déprotonation des espèces nucléophiles impliquées dans la réaction. Cependant, au delà de pH 8, des réactions secondaires sont observées. Il s’agit principalement de l’hydrolyse de la fonction thioester. De plus, à pH basique, la réaction n’est plus chimiosélective : le thioester peut dans certaines conditions réagir avec les amines des chaînes latérales des Lys (par exemple lors de ligations de deux fragments utilisant un excès du fragment thioester). Il a aussi été montré, qu’à pH élevé et lors du chauffage modéré du mélange réactionnel, le TCEP peut conduire à la désulfurisation des cystéines.¹⁴⁵ Cette réaction secondaire est observée lors de ligations réalisées en absence de thiol externe (thiophénol, MPAA, ...). L’introduction d’ascorbate de sodium permet alors d’éviter la désulfurisation.¹⁴⁶ Enfin, un pH plus élevé favorise l’oxydation des thiols. Le contrôle du pH du mélange réactionnel est donc indispensable.

- La concentration et la nature des thiols ajoutés au mélange réactionnel

Sans ajout de thiol externe dans le mélange réactionnel, nous n’avons pas détecté de cyclisation après 48 heures. L’ajout du MPAA permet de convertir in situ le peptide alkyl thioester (MPAL) en aryle thioester plus réactif vis-à-vis de l’attaque nucléophile par le thiol de la cystéine (un meilleur groupe partant étant introduit). Lors de l’optimisation des conditions de ligation, nous avons observé que l’augmentation de la concentration en MPAA, de 30 à 300 mM, augmente la cinétique de la réaction. Cependant, une

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concentration élevée en MPAA peut, dans certains cas, gêner le suivi de la réaction par HPLC du fait de la co-migration du thiol avec les espèces d’intérêt (peptide linéaire ou cyclique). Nous avons dans certains cas testé l’ajout du 2-mercaptoéthanesulfonate de sodium (MESNa), préconisé dans certains protocoles de ligation chimique.¹⁴⁷ La réaction est totale comme avec le MPAA mais plus lente comme attendu, le MESNa étant un dérivé thioalkyl.

- La concentration en guanidine

La guanidine est ajoutée si nécessaire au milieu pour augmenter la solubilité du peptide. Cet agent dénaturant est indispensable lors de la ligation de fragments peptidiques de poids moléculaire élevé pour la synthèse de protéines. L’ajout de guanidine s’est également révélé indispensable pour certains de nos peptides afin d’atteindre des concentrations de l’ordre du mM. Nous avons comparé pour la cyclisation du peptide R6W3

-MPAL, la cinétique de la réaction à deux concentrations différentes de guanidine (3 ou 6 M).

Dans les deux cas, le peptide, totalement soluble, était à la concentration de 2 mM. Cette expérience a montré que la vitesse de ligation diminue (réactions finies en 5h au lieu de 3h) lorsque la concentration en guanidine augmente, peut-être du fait de la viscosité plus élevée de la solution. Nos ligations ont donc été réalisées quand cela était possible en absence de guanidine ou à la concentration minimale.

Dans un tampon à pH ~ 7, en l’absence de chlorhydrate de guanidine, avec 30 mM de MPAA et autant de TCEP, la cyclisation de R6W3-MPAL (1mM) est pratiquement terminée au bout de 1h30. On observe une conversion totale du peptide thioester en peptide cyclique sans aucune réaction secondaire (Figure 60). Dans les mêmes conditions, la ligation de R9

-MPAL est quasi instantanée, tandis que celle de Tat--MPAL est finie en moins de 6h. La

cyclisation de Pen-MPAL, en présence de 3 M de guanidine, est totale en 10 heures. Une fois la réaction terminée, les peptides cycliques sont purifiés par HPLC. Il semble important de signaler que bien que le suivi par HPLC analytique de la cyclisation de R9 ne pose aucun problème, la purification du produit s’est avérée difficile et conduit à un mauvais rendement. Il semble en effet que le produit cyclique précipite lors de l’injection en HPLC de quantités plus importantes de produit. Ce problème a pu être partiellement surmonté en purifiant le peptide par de multiples injections HPLC.

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Figure 60 – Suivi de la cyclisation de R6W3-MPAL par HPLC en phase inverse. Des échantillons du mélange réactionnel ont été prélevés à différents temps (indiqués en rouge) et injectés en HPLC phase inverse. Conditions de la réaction de ligation : [R6W3] = 1mM dans un tampon contenant 200 mM phosphate de sodium, 2 mM EDTA, 30 mM MPAA, 30 mM TCEP, pH : 7.

2. Synthèse sur support solide en stratégie Fmoc de peptides comportant