3.1 Description
En établissant la frontière des connaissances dans le domaine (cf. Chapitre 2), le choix des éléments de notre stratégie s’est dessiné. Plusieurs d’entre eux sont déjà à disposition de par les études antérieures de notre groupe et des laboratoires partenaires de ce projet. Avant de les énoncer, rappelons l’objectif général qui est le développement d’un revêtement multifonctionnel de prothèse synthétique possédant les caractéristiques suivantes :
Applicable à une structure polymérique aux propriétés mécaniques définies (e.g. compliance) sans l’endommager ;
Résistant à l’adsorption de protéines et l’adhésion plaquettaire, i.e. non thrombogène ;
Favorable à l’adhésion et la prolifération de cellules endothéliales, i.e. endothélialisable ;
Défavorable à la prolifération des cellules musculaires lisses, i.e. ne contribuant pas à l’hyperplasie néointimale.
La prothèse synthétique dont il est question a été développée par Moreno et collègues (Moreno et al., 2011), partenaires de ce projet, et est décrite dans la partie 2.1.4. Il s’agit de structures non-tissées de PET dont les propriétés mécaniques ont été optimisées pour correspondre aux attentes pour de telles prothèses. Un des défis majeurs dans la conception de prothèses de petit diamètre est donc atteint, et le second doit être relevé (cf. partie 1.3.2).
L’expertise de notre groupe sur les biomatériaux protéinés est alors entrée en jeu. Nous rapportons dans cette thèse l’amélioration de la ré-endothélialisation de la prothèse de PET par le
greffage à la fois de peptides d’adhésion et de facteur de croissance, connus pour leur rôle sur les cellules endothéliales (cf. partie 2.3.3). Lors de cette biofonctionnalisation, l’accent a été mis sur le développement et l’utilisation de méthodes de caractérisation appropriées. L’idée est de permettre un contrôle rigoureux des modifications apportées à la structure, en termes de
conservation des propriétés mécaniques (cf. parties 2.1.1 et 2.6.1) et de contrôle/optimisation des densités de peptides/protéines greffées (cf. parties 2.5.2.5 et 2.6.2).
Enfin, pour assurer une action spécifique aux cellules endothéliales, et non aux plaquettes et cellules musculaires lisses, une composante anti-thrombogène a été ajoutée au revêtement et les
biomolécules ont été judicieusement sélectionnées dans la littérature pour leur rôle spécifique sur les cellules endothéliales.
3.2 Hypothèses
Hypothèse 1. Les structures de PET peuvent être fonctionnalisées efficacement sans affecter leurs propriétés mécaniques par voie chimique (cf. partie 2.5.1).
Hypothèse 2. L’utilisation d’un espaceur à base de polyéthylène glycol (PEG) permet d’assurer une faible thrombogénicité des surfaces et d’étudier spécifiquement le rôle des biomolécules greffées (cf. parties 2.2.4 et 2.5.2.4).
Hypothèse 3. Il existe un peptide permettant l’adhésion sélective des cellules endothéliales par rapport aux cellules musculaires lisses et aux plaquettes (cf. partie 2.3.3.1).
Hypothèse 4. Un revêtement de dextrane représente une alternative naturelle et moins coûteuse au PEG (cf. hypothèse 2 et partie 2.2.4)
Hypothèse 5. Le facteur de croissance VEGF améliore la prolifération des cellules endothéliales mais pas celle des cellules musculaires lisses (cf. parties 2.3.3.2 et 2.4.2).
Hypothèse 6. La densité de peptides/protéines greffés a une influence importante sur les effets cellulaires observés et peut être optimisée (cf. partie 2.5.2.5).
Hypothèse 7. La co-immobilisation de peptides d’adhésion et de VEGF amène une synergie au niveau de l’adhésion et de la prolifération cellulaire, pouvant être optimisée en jouant sur les densités (cf. partie 2.3.3.3).
3.3 Objectifs spécifiques
Chacun des trois objectifs suivants a été au cœur de publications distinctes, présentées dans les chapitres 4, 5 et 6, respectivement.
Objectif 1. Amener des groupements réactifs à la surface des structures de PET sans en affecter les propriétés mécaniques (Hyp. 1).
Objectif 2. Développer un revêtement permettant à la fois l’adhésion de cellules endothéliales et la résistance à l’adhésion de plaquettes (Hyp. 2, 3 et 6).
Objectif 3. Développer un revêtement assurant l’adhésion et la prolifération de cellules endothéliales sans favoriser la prolifération des cellules musculaires lisses (Hyp. 3 à 7).
3.4 Composantes des revêtements développés
1. Un long polymère aminé, tel que le polyvinylamine (PVAm) ou le polyallylamine (PAAm), a été employé pour atteindre l’objectif 1 en se basant sur l’hypothèse 1. Plus précisément, nous supposons ici que le greffage de PVAm (ou PAAm) se limitera à la surface des structures, du fait d’une faible diffusion, et n’affectera pas les propriétés du volume. Les deux polymères seront considérés comme équivalents (cf. Annexe A).
2. Un espaceur/lien tel que le PEG et le dextrane a été greffé aux amines primaires du PVAm (ou PAAm). Les hypothèses 2 et 4, basées sur la littérature, ont orienté nos choix vers ces macromolécules. Ces intermédiaires entre la surface et les biomolécules auront pour rôle à la fois d’assurer l’anti-thrombogénicité et de permettre l’étude spécifique du rôle des biomolécules en évitant l’adsorption de protéines.
3. Les peptides d’adhésion REDV, CAG et YIGSR, ainsi que RGD (contrôle positif) ont été retenus et testés pour atteindre l’objectif 2 en se basant sur l’hypothèse 3.
4. Le peptide K5 et son partenaire E5-VEGF ont également été incorporés au revêtement avec le peptide d’adhésion retenu, pour atteindre l’objectif 3 en se basant sur les hypothèses 5 et 7.
3.5 Considérations pratiques
3.5.1 Substrats utilisés
Les structures de PET présentées à la partie 2.5.1 n’ont été utilisées que pour le premier article présenté dans cette thèse en Chapitre 4. Par la suite, des films de PET (cf. Chapitre 5) et des plaques à puits (cf. Chapitre 6), tous deux fonctionnalisés avec le PVAm (ou le PAAm), ont été employés. Ce changement de substrat a été fait pour plusieurs raisons :
Par souci de commodité et d’économie : la manipulation de substrats fibreux est moins aisée que celle de plaques à puits ou de films, et nécessite une quantité de matériel plus importante. L’utilisation de substrats plus simples a ainsi permis de multiplier les contrôles et caractérisations (cf. partie 3.5.2)
Pour faciliter la comparaison à la littérature : notamment lors de l’étude des densités, les substrats 2D (films, puits) sont plus courants et moins spécifiques que les structures fibreuses ;
Du fait de l’arrêt du projet au CNRC (après le Chapitre 4), nous empêchant l’accès aux bancs d’essai pour les tests sur structures tubulaires.
Toutefois, le fait que la première couche du revêtement soit faite du même polymère aminé devrait faciliter le transfert aux structures réalistes in fine. Quelques résultats de transfert aux structures non-tissées sont présentées en Annexe E.
3.5.2 Caractérisation et contrôle
Tout au long de la thèse, une attention particulière a été portée à la caractérisation des revêtements développés et à l’utilisation de contrôles appropriés.
L’objectif 1, imposant une double caractérisation mécanique et chimique, a mené à l’utilisation d’une méthode rapide, simple et peu coûteuse pour caractériser la densité de groupements réactifs. Une première publication de méthodologie a ainsi été issue des travaux de cette thèse et écrite en collaboration avec un collègue (Noel, Liberelle, Robitaille, & De Crescenzo, 2011).
Lors de la réalisation de l’objectif 2, des séquences peptidiques mutantes (e.g. RGE et REVD) ont été utilisées comme contrôle, ce qui est malheureusement rarement fait (Tableau 2-3). Tous les peptides ont été greffés de manière covalente et spécifique au thiol, via l’ajout d’une étiquette Cys- Gly-Gly (cf. Annexe D). Considérant l’hypothèse 6, l’adhésion cellulaire a été étudiée en fonction de la densité de peptides.
Lors de la réalisation de l’objectif 3, VEGF a été capturé de manière stable et orientée par le peptide K5 préalablement greffé de manière covalente (tout comme les peptides d’adhésion). Ce type de capture est rarement employé au profit de la chimie carbodiimide (Tableau 2-4), plus simple mais présentant de nombreux défauts quant à l’orientation des protéines (cf. partie 2.5.2.2). La densité de VEGF étant rarement caractérisée (Tableau 2-4) et variée (Tableau 2-6), elle a été considérée dans ce projet et scrupuleusement caractérisée par des méthodes dérivées de l’ELISA.