CHAPITRE IV : CARACTERISATION DES SURFACES FONCTIONNALISEES PAR
C. Détection électrochimique d’ADN après immobilisation des sondes sur surface d’or
C.3. b. stabilité des électrodes fonctionnalisées par les sondes N 3 In’1Fc, N 3 In’4Fc et Tb(N 3 ) 3 In’4Fc
Tb(N3)3In’4Fc
Par analogie à ce qui a été fait précédemment, la stabilité des sondes N3In’1Fc, N3In’4Fc et
Tb(N3)3In’4Fc a également été étudiée, selon le même protocole opératoire (Figure IV.C.8.)
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 var ia ti on de Iox (% ) jours N3In’1Fc N3In’4Fc Tb(N3)3In’4Fc
Figure IV.C.8. : Etude de stabilité en solution de tampon d’analyse PBE des électrodes
fonctionnalisées par N3In’1Fc (en bleu), N3In’4Fc (en rouge) et par Tb(N3)3In’4Fc (en vert).
167 Chacune des électrodes a subi au minimum 9 expériences d’hybridation durant le temps de suivi. En raison d’une variation de courant plus importante, l’étude a été menée sur une
période de 45 jours. En effet, si le comportement des sondes N3In’1Fc et Tb(N3)3In’4Fc sont
relativement similaires à ce qui a été décrit précédemment, la sonde N3In’4Fc connait quant à
elle une plus grande perte d’intensité. En effet, dans les 10 premier jours, une perte de 30 % est enregistrée, puis le signal semble se stabiliser, sans que des variations notoires d’intensité ne soient observées sur les 35 jours suivants. La densité de greffage de cette sonde est environ
3 fois inférieures à celles des sondes N3In’1Fc et Tb(N3)3In’4Fc. La même réflexion peut être
menée si l’on compare les stabilités des électrodes modifiées par les sondes DTPA et celles modifiées par le dérivé DTPA-héxynyle suivi par les sondes via la chimie « click ». Une plus faible densité de greffage semble impacter la stabilité de la couche sensible du capteur. Une couche plus dense de sondes sur l’électrode permet de mieux résister aux différentes attaques chimiques entrainant la coupure de liens Au-S (mécanisme de réduction ou d’oxydation des thiols dans les tampons.).
Contrairement à ce qui était attendu, la sonde Tb(N3)3In’4Fc qui présente un plus grand
nombre de liens Au-S avec la surface (si tous les azotures ont réagi avec la surface) ne se
montre pas plus stable que ses analogues N3In’1Fc et N3In’4Fc. Ce résultat semble signifier
que, dans le cas de la réaction de « click » électrocatalysée avec la surface, un plus grand nombre de groupements azoture n’affecte ni le rendement de couplage sur la surface (la
densité de greffage étant similaire à celle de la sonde N3In’1Fc), ni la stabilité de la sonde sur
la surface. Les conditions optimales pour ces deux paramètres sont déjà obtenues par la modification des ODN par une seule fonction azoture.
168 D. Conclusion
L’utilisation d'une chaîne alkylthiol basée sur le motif DTPA a permis d'envisager le greffage de diverses sondes ODN sur électrode d'or, selon différents procédés.
Il a été montré en premier lieu qu'il était possible de réaliser la réaction de « click » électrocatalysée à partir de l'élément d'ancrage bis(DTPA) héxynyle 7. La réaction a permis l’immobilisation sur électrode d’or de la sonde oligonucléotidique fluorescente 14, ce qui a pu être observé par microscopie optique de fluorescence. Cette preuve visuelle a permis de confirmer qu'il était possible d'utiliser la réaction de « click » électrocatalysée pour l'immobilisation d'oligonucléotides sur or.
En second lieu, nous avons effectué le greffage des sondes « hairpin » (DTPA)2In3Fc et
(DTPA)2In4Fc modifiées par une chaîne alkylthiol selon un protocole de déprotection des
thiols et une méthode de greffage similaire à ce qui a été effectué pour le bis(DTPA) héxynyle. Il a été ainsi démontré que le greffage se déroulait favorablement dans un tampon phosphate 100 mM (pH =8) en présence de tris(2-carboxyéthyl)phosphine/HCl (TCEP/HCl). L'immobilisation a été suivie par voltampérométrie cyclique grâce à la présence des ferrocènes. L’intensité du signal s'est montrée proportionnelle au nombre de ferrocènes constituant la sonde immobilisée. Ceci a permis de valider notre stratégie initiale envisagée pour la position des ferrocènes sur la tige des structures « hairpin »
En troisième lieu, l'immobilisation des sondes modifiées par des azotures N3In’1Fc, N3In’4Fc
et Tb(N3)3In’4Fc a pu être réalisée par couplage de ces dernières par réaction de « click »
électrocatalysée, sur des électrodes d'or fonctionnalisées par le bis(DTPA) héxynyle. La réaction est effectuée dans des conditions similaires à ce qui a été étudié précédemment et la confirmation de l'immobilisation est donnée par CV, grâce à la présence des groupements ferrocényle en 3’. En regard des densités obtenues, nous pensons que le greffage de la sonde
N3In’4Fc n’a pas fonctionné correctement et le manque de matériel ne nous a pas permis de
répéter cette expérience d'immobilisation. Néanmoins, à densité de greffage équivalente, entre
les sondes N3In’1Fc et Tb(N3)3In’4Fc, nous avons bien pu constater une augmentation de
l'intensité de la réponse par CV par rapport au nombre de groupes ferrocényle, d’un facteur 4 environ.
169 Nous avons pu effectuer des expériences d'hybridation pour les deux familles de sondes «hairpin». La variation du signal fourni par les sondes en présence d'une cible ADN a été suivie par CV. L'ajout de cible non complémentaire contribue à la stabilisation du signal et
n’altère pas notablement la valeur de l'intensité du pic d'oxydation Iox. À la différence, l’ajout
de la cible complémentaire tend à faire diminuer de manière significative Iox, avec une
variation minimale de cette valeur de 15%. Les voltammogrammes observés illustrent clairement l’impact de la réaction d’hybridation et du changement de structure de la sonde sur la réponse électrochimique du système.
Le suivi de ce paramètre en CV a permis de déterminer les limites de sensibilité des systèmes. Une sensibilité minimale de l’ordre de 100 fM a été déterminée.
Enfin la stabilité des électrodes soumises à de nombreuses analyses CV en tampon durant les tests d’hybridation a été étudiée sur plusieurs jours. Les analyses CV ont été menées sur un domaine de potentiels de -0,1 V à +0,9V vs ECS à température ambiante intercalées par des périodes de stockage en tampon. Ce suivi révèle une faible dimunition de l’intensité du signal au cours du temps sur une période de 20 à 40 jours, selon les familles de sondes. Ces variations d’intensité du signal n’ont pas impacté les capacités de détection du système.
170 E. Partie expérimentale
E.1. Immobilisation de l’ODN modifié par la Cy5 sur surface d’or, et observation par