Etude en microscopie à fluorescence de la surface d’or fonctionnalisée par la biotine via des

L’approche d’électroadressage via cette méthode est mis en évidence par l'immobilisation de nanoparticules fluorescentes fonctionnalisées par la streptavidine. Après l'étape d’immobilisation de l'azide-PEG3-biotine sur surface d’or, cette dernière est mise en contact

avec 100 μL d'un mélange de BSA et de Tween (100 mM NaPO4, 1% massique de BSA et

0,1% massique de tween), une demi-heure à température ambiante pour éviter tout

phénomène d'adsorption non spécifique sur or¹⁸³. L’électrode est ensuite lavée à l’eau

distillée, et les nanoparticules sont déposées sur électrode afin de former le complexe biotine/streptavidine sur la surface. La rhodamine est excitée par une longueur d'onde d'excitation adéquate et la réponse de désexcitation des nanoparticules est observée par microscopie optique. Les échantillons sont observés sur la bordure de la surface fonctionnalisée des électrodes d’or afin de vérifier l'efficacité de la réaction de « click » par électrocatalyse (Figure II.C.9).

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(b)

(a)

Figure II.C.9 : électrodes d'or observées par fluorescence au microscope optique après la réaction de « click » et reconnaissance des nanoparticules fluorescentes de streptavidine. La réaction de « click » est électrocatalysée à un potentiel de : (a) -300 mV (b) +300 mV.

Deux régions distinctes sont clairement visibles sur la figure II.C.9.a. : La première où l'on peut voir la fluorescence des nanoparticules rhodamine-streptavidine immobilisées sur les électrodes fonctionnalisées par la biotine et la zone « éteinte » en dehors du cercle de fonctionnalisation de l'électrode d’or. L'expérience témoin, où un potentiel de + 300 mV est appliqué lors de la réaction de « click » de la biotine, est représentée par les clichés de microscopie optique de la figure II.C.9.b. Après application de la longueur d'onde d'excitation de la rhodamine, on ne constate aucune zone éclairée par fluorescence de désexcitation. Ces résultats sont donc en accord avec les observations qui ont été effectuées par l'analyse de la surface en impédance électrochimique. Ce résultat visuel est donc, une fois encore, très encourageant pour la mise en place d'un système électroadressable.

D. Conclusion

Les études de réalisation de l’électrocatalyse de la réaction « click » sur électrode d’or ont été menées dans ce chapitre. Le greffage par la formation d’un 1,2,3-triazole entre un alcyne immobilisé sur la surface et un dérivé azoture peut être contrôlé par application d’un potentiel négatif pour générer in situ une espèce Cu(I) active pour la catalyse. Un potentiel optimal a été identifié, en utilisant du sulfate de cuivre et un ligand TBTA propice à la réduction de ce dernier en Cu(I). Les paramètres déterminés se montrent efficaces sans qu’un électrodépôt de cuivre métallique sur la surface d’or ne soit observée.

93 L’approche de la réaction de « click » électrocatalysée a permis la fonctionnalisation sélective de nos électrodes d’or avec de bons rendements. Il a été démontré que la réaction de « click » se réalise sur la surface si, et seulement si, un potentiel spécifique de -300 mV vs Ag/AgCl est appliqué.

Ces résultats ont été démontrés dans un premier temps par l’immobilisation sur la surface d’une espèce rédox active : Le 2-azidoéthyl ferrocène 6. L’avancement de la réaction a été suivie par cyclovoltampérométrie cyclique. La caractérisation par XPS de la surface de l’électrode a apporté la confirmation de cette immobilisation.

Dans un second temps, l’efficacité de la réaction a été mise en évidence par l’immobilisation de nanoparticules fluorescentes modifiées en surface par des fonctions azoture. Le greffage de ces particules a été observé par microscopie optique de fluorescence. Il a été ainsi acquis une preuve visuelle de cette chimie électrocatalysée.

Nous avons enfin démontré par spectroscopie d’impédance que la réaction de « click » électroassistée est efficace pour l’immobilisation de la streptavidine, sous sa forme naturelle, ou ancrée sur nanoparticule. Une couche intermédiaire de streptavidine permet d’immobiliser par la suite des entités biotinylées supplémentaires, tel qu’il a été démontré pour l’immobilisation de l’albumine sérique humaine sur nos supports.

En outre, l’alkylthiol utilisé dans cette étude, le bis(DTPA)héxynyle, se révèle être un élément d’ancrage sur or compatible avec l’application d’un vaste domaine de potentiels (-0,5 V à +0,9V vs ECS), avec des conditions de stabilité supérieures aux monothiols plus classiques. Le stockage des électrodes sous tampon à température ambiante peut dépasser une période de 20 jours sans qu’il ne soit observé de variations notables d’intensité du signal. Ce composé s’annonce donc très prometteur pour la réalisation de biocapteurs robustes pour la détection multiplexée de cibles pour un diagnostic médical efficace.

Un système performant d’immobilisation sur or par un mécanisme électroassisté a ainsi été mis au point avec un certain nombre de dérivés de différentes taille et composition chimique. Il reste encore à démontrer la fiabilité de ce système pour l’élaboration d’un biocapteur spécifique et sensible.

94 E. Partie expérimentale

E.1. Activation de la surface d’or

Les solutions aqueuses ont été préparées à partir d’eau déionisée par un système Milli-Q (Millipore, Bedford, MA). Sauf indication contraire, toutes les analyses ont été conduites dans une solution d'électrolyte d'analyse (PBE). Il s'agit d'un tampon phosphate (20 mM) de pH = 6,4, avec du perchlorate de sodium pour électrolyte (250 mM). Les solutions sont désoxygénées par un flux d'Argon avant utilisation. Les mesures électrochimiques sont réalisées avec un compartiment conventionnel à 3 électrodes, de volume interne compris entre 1,5 mL à 5 mL (Verre Equipements, Collonges au Mont d’Or, France), fermé hermétiquement d'un côté avec une électrode laminaire d'or (7 mm² de surface) utilisée comme électrode de travail et, de l'autre côté, fermée avec une électrode laminaire de platine (38,5 mm² de surface) utilisée comme contre électrode (Figure E.1.).

Figure E.. :Cliché de la céllule d’analyse électrochimique

Une électrode au calomel saturée au chlorure de potassium (ECS) de Radiometer Analytical (Villeurbanne, France) a été utilisée comme référence. Ce système est connecté à un potentiostat Bio-Logic VMP2 (Bio-Logic Science Instruments, Pont de Claix, France). Les résultats sont enregistrés avec le logiciel EC-Lab fourni par Bio-Logic Science Instruments.

95 L'activation de la surface d'or est réalisée dans le système d'analyse dans lequel sont introduits 5 mL d'une solution de soude à 0,5M. Au besoin, l’électrode de platine et préalablement nettoyée à l'acide sulfurique concentré puis rincée à l'eau distillée et finalement séchée. Après l'application d'un potentiel de départ de 0 mV, une série de 10 cycles en voltampérométrie cyclique a été effectuée entre -400 mV est -1400 mV. Le potentiel de fin du programme est de -1400 mV.