Greffage de biosondes sur surface d'or par la méthode des monocouches auto-assemblées de dérivés

Les équipes de Nuzzo et Coll.⁸⁹ ainsi que de Bain et coll.^90-92 ont été pionnières quant à la

modification d'électrodes par des alkylthiols pour des applications de capteurs. Cette technique est la plus répandue pour le greffage de biomolécules sur des électrodes de différente nature, tels que l'or, l'argent, le platine ou le cuivre.

Les alkylthiols s’adsorbent spontanément sur ces surfaces pour former des liens covalents avec le métal. Il en résulte la formation d'une monocouche de chaînes alkyles, diversement fonctionnalisées, qui possède une inclinaison de 20° à 30° par rapport à la normale du plan.

36 Une fois la surface du métal nettoyée, la solution d'alkylthiols forme rapidement une

monocouche, suivie d'une lente réorganisation pouvant durer plusieurs heures⁹⁰. Les

monocouches mixtes peuvent être formées en mettant en contact, avec la surface, une solution ou les espèces à greffer sont toutes présentes. Il en résulte une monocouche relativement

homogène des différentes molécules⁹². Dans le cas où la longueur des chaînes entre les

différents composés est très importante, il est nécessaire de commencer le greffage de la surface par les chaînes les plus longues, puis d'uniformiser la monocouche en mettant la

surface en contact avec la solution contenant les chaînes les plus courtes⁹³ .

Toutefois, il est à noter que ce procédé possède une limitation d'utilisation. L'énergie de la

liaison Au-S n'est que de 30 à 45 kcal/mol ⁹⁴ ce qui s’avère être notablement plus faible

qu’une liaison covalente C-C, de l'ordre de 80-150 kcal/mol. Ces faibles valeurs d'énergie de liaison induisent une relative instabilité dans le temps de la monocouche alkylthiol et obligent les opérateurs à travailler dans une gamme de potentiels compris entre -1 V et +1 V vs ECS. Cette fenêtre varie en fonction de la longueur des chaînes et les groupements chimiques

terminaux utilisés^95-96. La liaison Au-S est sujette à l'oxydation sous forme de sulfinate (SO2^-)

ou de sulfonate (SO3^-) en présence d'oxygène et de lumière⁹⁷. La sensibilité à l'oxydation des

thiols est directement fonction de la longueur et du groupement terminal de la chaîne⁹⁸. Les

soufres oxydés ainsi formés ont une énergie de liaison plus faible que les thiolates à la surface de l'or, provoquant des lacunes dans la monocouche et compromettant la stabilité des signaux

électrochimiques⁹⁹.

Une autre approche pour stabiliser l'accroche des éléments thiol sur la surface d'or consiste à augmenter le nombre de liaisons soufre par entité chimique à greffer. C'est ainsi que l'équipe

de Liepold et Coll. ¹⁰⁰ a imaginé des oligonucléotides présentant plusieurs groupements thiols

voisins sur la partie terminale de la sonde. L'accroche à la surface se fait par des unités appelées dithiolphosphoramidite (DTPA), compatibles avec la synthèse automatisée d'oligonucléotides. L'augmentation du nombre de ces unités au sein d'une même sonde oligonucléotidique permet d'accroître de façon plus que significative la stabilité du greffage des sondes au cours du temps. Il est toutefois noté une légère baisse de la surface fonctionnalisée, qui s'explique vraisemblablement par une gêne stérique engendrée par les sondes déjà greffées à la surface d'or.

En dépit de ces limitations, les monocouches alkylthiols sont très utilisées pour la

fonctionnalisation de surface par des biomolécules telles que des peptides^101-102, des PNA¹⁰³

ou de l'ADN⁹³. Le greffage d'oligonucléotides sur des surfaces or a particulièrement été

37 conformation des brins sondes greffés sur la surface de détection. Cette modification de conformation en forme duplex rigidifie le brin, réduisant considérablement sa mobilité dans la solution et modifiant son angle d'inclinaison par rapport à la surface d’or. De ces observations, de nombreuses études physico-chimiques et électrochimiques ont été menées

sur le comportement des brins d'ADN lorsqu'ils sont sous forme simple brin^{30, 104} ou

duplex¹⁰⁵.

Kelley et Coll. ont notamment pu observer que le double brin d'ADN faisait un angle de 45°

avec la normale du plan¹⁰⁶, légèrement supérieur à celui observé pour des chaînes alkylthiol

conventionnelles.

Tarlov et coll.^{93, 107} ont procédé à l'immobilisation de mercaptoalcool de taille identique au

bras alkylthiol de l’oligothiol utilisé. Cette « passivation » a pour effet de combler les lacunes et de redresser la base des sondes, permettant une meilleure organisation de la monocouche à la surface de l'électrode (Figure I.B.1.)

(CH2)6SH

HO(CH₂)₆SH

=

Au

Figure I.B.1. : Méthode de passivation de la surface par du mercaptoalcool employée par Tarlov et Coll.

L'organisation en monocouche des sondes greffées à la surface par des liens thiol amplifie la variation de signal due aux changements de conformation induits par l'hybridation avec la cible complémentaire. Ces effets de structure sont d'une grande importance dans l'optique de la mise au point d'un système de détection par électrochimie sur surface d'or.

La fonctionnalisation de surface d'or par adsorption des thiols a également permis la mise au

point de systèmes de multidétection ¹⁰⁸ . Contrairement aux méthodes utilisant des sels d'aryl

diazonium ou des poly(pyrrole), il est nettement plus difficile, par la méthode des alkylthiols, d'envisager un adressage de sondes diverses sur un système à plots multiples. Les temps de greffage sont bien plus longs, le micro spotting est difficile et il n'existe aucune méthode

38 connue d’électroadressage. Pavlovic et coll. ont donc imaginé une stratégie singulière. Leur système de départ est préventivement greffé par une première sonde. La suite de la manipulation consiste à remplacer cette sonde par désorption sélective d’une partie des plots

108

. Ils ont ainsi pu faire une multidétection pour deux cibles différentes sur la même puce. Ce procédé est toutefois très limité car il n'empêche pas totalement les contaminations plots à plots.

Une autre méthode de greffage faisant intervenir des thiols consiste à synthétiser des oligonucléotides phosphorothioates. À partir de la méthode de synthèse supportée des

phosphorothioates développée par l'équipe de Beaucage¹⁰⁹, des oligonucléotides sont modifiés

sur quelques phosphates internucléosidiques de leur extrémité 3’ ou 5’ ^110-111 (Figure I.B.2.).

Figure I.B.2. : système de détection électrochimique de type « sandwich » développé par

Iharra et Coll.¹¹⁰ faisant intervenir une sonde de détection modifiée par des fonctions

phosphorothioates qui permettent son immobilisation sur la surface de l'électrode

Ce type de sonde oligonucléotidique chemisorbée sur une surface d'or a été utilisé par Ihara et

Coll. ¹¹⁰ afin de développer un système de détection électrochimique de type « sandwich ».

Une première sonde oligonucléotidique de détection, complémentaire d’une partie de la cible ADN à détecter, est tout d'abord fixée sur l'électrode. La cible ainsi qu'une deuxième sonde oligonucléotidique de détection, complémentaire d’une autre partie de la cible, sont ensuite introduites dans le système. La deuxième sonde est modifiée par une molécule de ferrocène. Le « sandwich » ainsi formé permet l'obtention d'un signal électrochimique qui ne peut apparaître qu'en présence de la cible complémentaire. Le signal est alors dit « ON ». Cette méthode de greffage est relativement facile à mettre en œuvre, mais la densité de greffage de sonde est bien moindre que dans le cas d'une fonction thiol située à l'extrémité de l'oligonucléotide.

B.2. Electro-fonctionnalisation de surface d'or par des sondes oligonucléotides via le