3.4.1 Spectroscopie à l'équilibre.
L'état d'oxydoréduction et de ligation des hèmes des oxydases est suivi par spectroscopie d'absorption UV/vis à l'équilibre. Les spectres sont pris entre 250 et 700 nm sur un spectrophotomètre Shimazu 1601PC par pas de 1 nm avec une vitesse de balayage de 100 nm par minute.
La différence entre le spectre réduit et le spectre oxydé est mesurée. L'oxydase oxydée est obtenue en ajoutant une très faible quantité de ferricyanure (KFe(CN)6) et la réduite par ajout
d'hydrosulfite. Une cuve contenant l'échantillon oxydé est placée dans le faisceau de référence et l'échantillon réduit dans le faisceau de mesure. Le spectre obtenu est le spectre de différence. La concentration est estimée en utilisant le coefficient d'absorption molaire à 605 nm ∆
ε
605=24.3mM-1.cm-1 pour l'oxydase mitochondriale et 23.4 mM-1.cm-1 pour celle de P. denitrificans (Nicholls 2001).
3.4.2 Spectroscopie femtoseconde.
3.4.2.1 Principe de fonctionnement.
La technique est basée sur la rupture de la liaison entre le fer d'une hémoprotéine et son ligand (CO, O2, NO mais pas CN) induite par l'absorption d'un photon (Martin et coll. 1983;
Martin & Vos 1994). Ce phénomène, considéré comme non physiologique, permet de synchroniser la dissociation d'une population de protéines et donc de suivre la dynamique du système.
La variation de l'état de ligation et/ou d'oxydoréduction induit des changements dans le spectre d'absorption des hèmes. Ces modifications sont suivies à l'aide d'autres impulsions de faible puissance. Ces impulsions sont appelées impulsions sonde par opposition aux impulsions dites pompe qui rompent la liaison. Cette technique est ainsi appelée spectroscopie pompe-sonde (figure 3.2).
En faisant varier le délai entre la pompe et la sonde, il est possible de tracer la cinétique du changement d'état d'oxydoréduction et/ou de ligation. Dans les techniques ultrarapides, ce délai est réalisé en faisant varier la différence de chemin optique parcouru par la pompe et par la sonde.
3.4.2.2 Description de l'expérience d'absorption femtoseconde.
Le montage expérimental qui a servi aux expériences peut être séparé en quatre parties°: 1. création et amplification de l'impulsion.
La source lumineuse est un laser à colorant qui émet des impulsions de 50 fs centrées à 620 nm à un taux de répétition de 100 MHz, avec une énergie par impulsion de 0,1 nJ. Une fraction des ces impulsions est amplifiée par un laser Nd:YAG doublé (Néodymium : Yttium- Aluminium-Garnet) (émettant à 532 nm un faisceau de 340 mJ par impulsion de 7 ns à 30 Hz) au niveau d'une chaîne de quatre amplificateurs à colorants. L'inversion de population est induite par le passage de l'impulsion amplificatrice, et l'émission stimulée est synchronisée par le passage de l'impulsion femtoseconde. Après cette étape une impulsion de 50 fs est obtenue avec une énergie de 0.5°mJ à 620 nm avec un taux de répétition de 30 Hz. Le faisceau est alors divisé en deux. Une partie va servir à créer l'impulsion de pompe et l'autre l'impulsion sonde.
2. Amplification du faisceau pompe.
La longueur d'onde de l'impulsion pompe est modifiée de sorte qu'elle puisse exciter spécifiquement l'échantillon. Cette modification s'effectue en deux étapes. Tout d'abord le faisceau est rendu polychromatique par la création d'un continuum dans une cuve d'eau. Puis il
est réamplifié dans une région spectrale déterminé par le choix du colorant, qui est excité à 532 nm par le YAG. Dans le cas de l'oxydase, le maximum de l'impulsion sonde est choisi à 595 nm, cette longueur d'onde est la plus favorable pour exciter préférentiellement les hèmes de type a liés (figure 4.1). Le faisceau pompe est ensuite envoyé sur un miroir "coin cube " monté sur un moteur pas à pas. Cette partie du montage est appelée ligne de retard car c'est ici que le délai entre la pompe et la sonde est généré.
3. Création de la sonde.
Parallèlement, un second continuum est créé par la focalisation du faisceau dans une cuve d'eau. Ce faisceau de faible énergie est utilisé comme sonde.
4. Analyse de l'échantillon.
Les faisceaux pompe et sonde sont alors focalisés et superposés dans l'échantillon sur une surface d'environ 104 µm². Le faisceau sonde transmis par l'échantillon, passe par un polychromateur et son spectre est enregistré par une camera CCD. Le fichier obtenu est une matrice donnant le changement d'absorption en fonction de la longueur d'onde et du délai pompe sonde. Dans les conditions utilisées; l'énergie de pompe est adaptée à l'excitation de ~20% des molécules présentes dans le volume illuminé (Vos & Martin 1999).
Les échantillons à analyser (cf § 3.3.7) sont placés sur un porte-cuve mobile. Ce déplacement évite que deux impulsions successives ne viennent exciter la même zone de l'échantillon. Des spectres à l'équilibre sont pris avant et après chaque expérience.
5. Analyse des résultats.
Deux types de procédures ont été utilisés :
Soit les cinétiques sont analysées à quelques longueurs d'onde et dans ce cas, les cinétiques sont ajustées sous Origin®. Soit, si la variation du spectre en fonction du temps donne des informations plus pertinentes alors une analyse globale est utilisée et les spectres associés aux déclins exponentiels sont déterminés.
3.4.3 Spectroscopie d'absorption nanoseconde.
Il s'agit également d'une technique pompe sonde, mais ici la sonde est quasi monochromatique et le délai est réglé électroniquement. La résolution temporelle est déterminée par la durée des impulsions (5 ns) et la fenêtre temporelle s'étend au delà de la seconde. L'échantillon est ici aussi excité à 595 nm. Les expériences ont été effectuées au laboratoire de physiologie membranaire et moléculaire du chloroplaste CNRS UPR 1261 dépendant de l'institut de biologie et de physico-chimie (IBPC, FRC 550, CNRS) à Paris en collaboration avec le Dr Fabrice Rappaport. Ici tout l'échantillon est excité à chaque impulsion et le taux de répétition était de 0,2 Hz. Les spectres de transition et les cinétiques sont construits point par point. Des spectres à l'équilibre sont mesurés avant et après les expériences sur un spectrophotomètre à barrettes Hewlet Packard.
3.4.4 La résonance paramagnétique électronique (RPE).
La RPE est une spectroscopie d'absorption micro-onde qui permet l'étude des espèces paramagnétiques caractérisées par la présence d'électrons célibataires. Dans les systèmes biologiques, les radicaux libres (monoxyde d'azote, peroxyde) et les ions des métaux de transition donnent un signal RPE. Le remplissage incomplet des couches électroniques périphérique du fer, du cuivre, du manganèse, du molybdène et du cobalt, pour ne citer que les plus fréquents dans les protéines, permet leur observation par spectroscopie RPE.
Le principe de la RPE.
Selon les lois de la mécanique quantique, pour un électron (S=1/2), les deux niveaux d'énergie sont dégénérés. En présence d'un champ magnétique ces deux états ne sont plus de même énergie :
E = +/- ½ g β B
Où E est l'énergie de Zeeman, g le facteur caractéristique du système étudié, β le magnéton de Bohr électronique et B le champ magnétique. Un photon de radiation micro-onde
lorsque l'écart d'énergie entre ces deux niveaux équivaut exactement l'énergie des photons de la radiation électromagnétique :
∆E = hν = gβB
Avec h la constante de Planck et ν la fréquence de la radiation électromagnétique.
Une source de micro-onde produit une radiation dont la fréquence est fixée par le spectrophotomètre (dans notre cas 9 GHz, bande X) et les conditions de résonance sont déterminées en faisant varier le champ magnétique. L'absorption de l'onde en fonction du champ B est mesurée puis sa dérivée est calculée. Cela permet d'améliorer la sensibilité. Les absorptions sont identifiées par le rapport g= hν/βB
Le facteur g est caractéristique de la molécule dans laquelle sont localisés les électrons célibataires. Il dépend de la nature du centre paramagnétique et de l'environnement moléculaire de l'électron. Pour les radicaux, de spin ½ le facteur g est proche de 2.
Les expériences RPE ont été réalisées au laboratoire de Bioénergétique et d'ingénierie des Protéines (BIP, UPR9036 – CNRS) à Marseille en collaboration avec le Dr Wolfgang Nitschke. Les spectres ont été enregistrés à 15 et 50 K sur un spectromètre Bruker® ESP 300E.