Chromatographie de l'oxydase aa 3

La purification des protéines a été effectuée par chromatographie échangeuse d'anions à l'aide d'un système FPLC qui permet une bonne reproductibilité des expériences et un suivi aisé. Les propriétés optiques de l'oxydase ont été utilisées pour suivre l'élution de la protéine et de ses contaminants. Trois longueurs d'onde sont mesurées en continu. L'absorption à 280 nm est caractéristique des noyaux aromatiques et permet de caractériser l'ensemble des protéines. Comme les deux principaux contaminants, le complexe à cytochrome bc et le cytochrome c552,

contiennent un hème de type c et l'oxydase deux hèmes de type a, les longueurs d'onde 552 et 605 nm ont été choisies car elles représentent le maximum du spectre d'absorption des hèmes c et

Source 30Q®. La première étape permet de séparer l'oxydase aa3 de la majorité des autres

protéines membranaires. La séparation, basée sur la différence de charge globale entre l'oxydase et les autres protéines, est effectuée en augmentant, lors de l'élution, la force ionique du tampon. Ces variations de force ionique ont également pour but de déstabiliser les super complexes, majoritairement formés de l'association entre le complexe bc, cytochrome c membranaire et la cytochrome c oxydase. La variation de force ionique est effectuée en augmentant la concentration de NaCl. Des études précédentes, par exemple (Ludwig & Schatz 1980; Liebl et

coll. 1999; Otten et coll. 2001) ont montrés que l'oxydase aa3 de P. denitrificans est éluée pour

une concentration de NaCl ~240 mM, le complexe bc, ~340 mM et le cytochrome c552 vers

160 mM avec de nombreuses autres protéines. L'élution commence par un lavage à 130 mM de NaCl qui élimine les protéines n'ayant pas d'affinité pour la résine, puis un gradient de NaCl est appliqué pour "décrocher" successivement les différentes protéines enfin un nouveau lavage à 340 mM est effectué qui détache toutes les protéines. Afin d'obtenir un bon isolement de l'oxydase aa3, trois types de gradient ont été testés :

1- La figure 4.2 présente le chromatogramme obtenu par l'application d'un gradient 130-

350 mM sur les protéines membranaires solubilisées de P denitrificans. Lors de l'élution, trois pics principaux sont observés à ~160 mM, ~240 mM et ~340 mM. Les spectres de différence associés à ces pics sont présentés figure 4.2 droite. Ils indiquent clairement que l'oxydase aa3 se

trouve majoritairement dans le pic 2. Alors que les pics 1 et 3 contiennent respectivement le cytochrome c552 et le complexe bc.

2- Si la séparation des pics était satisfaisante dans les conditions précédentes, les fractions

du pic 2, où l'oxydase aa3 est majoritaire, contenaient d'autres hémoprotéines (voir spectre). Afin

de déstabiliser les interactions entre l'oxydase et le complexe III et surtout le cytochrome c552,

une augmentation brutale de concentration en NaCl est appliquée. Ce procédé permet d'obtenir une oxydase pure (Liebl et coll. 1999). La figure 4.3 montre le chromatogramme obtenu par un gradient 200-350 mM NaCl suivie d'un second lavage à 340 mM NaCl. Contrairement aux résultats précédents, le pic 2 apparaît comme un épaulement du pic 1. Les spectres de différence mesurés pour les fractions correspondant aux pics 1 et 3 sont similaires à ceux présentés figure 4.2. L'allure des spectres des fractions du pic 2 varie (voir insert de la figure 4.3), la séparation de l'oxydase aa3 des contaminants est meilleure à la fin du pic (spectre rose). La CcO aa3

obtenue par cette méthode est plus pure que celle purifiée précédemment. Par contre le rendement est plus faible, puisque l'oxydase purifiée n'est contenue que dans quelques fractions.

Figure 4.2 : À gauche le chromatogramme des protéines membranaires solubilisées de P.

denitrificans sur une résine DEAE sépharose CL6B éluées par un gradient 130-350 mM NaCl. Les

spectres de différence (réduit moins oxydé) des protéines solubilisées et des pics 1,2 et 3 sont présentés à droite. La courbe noire représente l'absorption à 280 nm, la rouge celle à 552 nm, la verte celle à 605 nm et la courbe bleue représente la conductivité.

Figure 4.3 : Chromatogramme des protéines membranaires solubilisées de P. denitrificans sur une résine DEAE sépharose CL6B éluées par un gradient 200-350 mM NaCl. Les spectres de différence du pic 2 sont présentés en insert.

La courbe noire représente l'absorption à 280 nm, la rouge celle à 552 nm, la verte celle à 605 nm et la courbe bleue représente la conductivité.

3- Un troisième type de gradient est testé afin de tenter de combiner pureté de

l'échantillon et rendement. Comme le changement brutale de concentration de NaCl a un effet bénéfique sur la séparation de l'oxydase aa3, le lavage à 130 mM est suivie par un 2nd à 200 mM

NaCl, l'oxydase est ensuite éluée par un gradient 200-350 mM NaCl. L'utilisation de ce gradient permet de bien séparer les pics 1 et 2 comme l'indique le chromatogramme présenté figure 4.4.

Les spectres des fractions des pics 1 et 3 sont similaires à ceux présentés figure 4.2. De plus l'analyse du spectre de différence des fractions du pic 2 (figure 4.4 insert) montre un échantillon relativement pur.

Figure 4.4 : Chromatogramme des protéines membranaires solubilisées de P. denitrificans sur une résine DEAE sépharose CL6B éluées par un gradient 200-350 mM NaCl. Le spectre de différence (réduit moins oxydé) du pic 2 est présenté en insert

La courbe noire représente l'absorption à 280 nm, la rouge celle à 552 nm, la verte celle à 605 nm et la courbe bleue représente la conductivité.

Figure 4.5 : Chromatogramme de l'élution de l'oxydase aa3 sur la résine Source 30Q. la zone hachurée correspond aux fractions sélectionnées.

La courbe noire représente l'absorption à 280 nm, la rouge celle à 552 nm, la verte celle à 605 nm et la courbe bleue représente la conductivité

L'utilisation de ce double lavage a bien eu l'effet escompté : une bonne séparation des contaminants de l'oxydase aa3 et une résolution suffisante qui permet d'avoir un rendement

Les fractions du pic 2 présentant le meilleurs rapport 605/552 nm sont regroupées, concentrées puis lavées à l'aide de microconcentrateurs afin de ramener la concentration de NaCl à 130 mM. Cet échantillon est alors déposé sur la seconde colonne contenant une résine Source 30Q® et l'oxydase aa3 est éluée par un gradient 130-350 mM NaCl. Le chromatogramme obtenu,

voir figure 4.5, montre deux pics principaux, le premier contenant l'oxydase aa3 ([NaCl] entre

160-260 mM) et le second majoritairement le complexe bc ([NaCl] ~330 mM]).

Le pic principal, entre 280 et 380 mL d'élution, est en fait la superposition de plusieurs pics. Afin de déterminer les fractions contenant l'oxydase la plus pure, les spectres de différence des différentes fractions qui composent ce pic ont été mesurés. Le spectre de l'épaulement vers 280 mL d'élution, a une allure similaire à celui du pic 1 obtenue lors de la première colonne, l'absorbance à 605, caractéristique de l'oxydase aa3 est faible. Au maximum du pic, le rapport

605/552 nm augmente après le sommet. L'épaulement à droite du pic est riche en complexe oxydase aa3:cytochrome c552. Seules les fractions les plus pures sont retenues, correspondant à la

zone hachurée de la figure 4.5, puis regroupées et concentrées. La protéine est alors aliquotée par 100 µL à 30 ou 50 µM, congelée rapidement dans N2 liquide, et conservée à -80°C.