Spécificité des anticorps anti-ClC-3

Anticorps anti-xClC-3

Les anticorps polyclonaux anti-xClC-3 que nous avons fait développer par deux lapins (lapins 65 et 120) ont été purifiées et testés sur des préparations membranaires d'ovocytes contrôle et d'ovocytes exprimant le xClC-3 ou le xClC-5 (voir paragraphe 2.3.). Nous avons constaté que nos deux lots d'anticorps reconnaissaient effectivement le xClC-3 exprimé dans l'ovocyte et qu'il reconnaissent également le xClC-5 (Figure 52). La réaction croisée avec le xClC-5, due à la forte homologie de séquence des deux protéines dans la région antigénique, est plus forte avec les anticorps du lapin 120 qu'avec ceux du lapin 65. Nous avons conclu que nos anticorps sont adaptés pour étudier le xClC-3 surexprimé dans un système cellulaire, mais qu'il ne se prêtent que difficilement à l'étude du xClC-3 natif dans des tissus ou lignées cellulaires.

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Nous avons également examiné la spécificité de nos anticorps au sein de l'embranchement ClC-3/4/5 chez le mammifère (rat). Les deux lots d'anticorps ont été testés sur des préparations membranaires d'ovocytes contrôle et d'ovocytes exprimant les différents membres de cet embranchement. La Figure 55 montre l'immunodétection par Western blot avec nos anticorps anti-xClC-3 sur les différentes préparations membranaires. Si on suppose que l'expression des différentes protéines ClC dans les préparations membranaires utilisées est comparable, il apparaît que nos anticorps ont une bonne affinité pour le rClC-4, une affinité moyenne pour le rClC-5 et une affinité faible pour le rClC-3. De plus, on note que les anticorps reconnaissent des bandes non-spécifiques sur toutes les préparations membranaires (y compris celle des ovocytes contrôle). Ces bandes n'apparaissent jamais avec nos préparations d'ovocyte. Nous n'avons pas d'explication à cela.

Par conséquent, chez le mammifère, nos anticorps ne permettent pas de discriminer le ClC-3 par rapport aux autres membres de l'embranchement ClC-3/4/5, du fait de la grande homologie de séquence des extrémités C-terminales de ces protéines. De plus, ils risquent de révéler des protéines qui ne sont pas apparentées. L'utilisation de ces anticorps pour l'immunodétection du ClC-3 natif dans des tissus ou lignées cellulaires paraissait donc hasardeuse.

Anticorps anti-rClC-3

La collaboration avec Dr. G. H. Idelson des laboratoires Alomone (Jérusalem) nous a permis d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre la queue cytoplasmique C- terminale du rClC-3. L'immunisation des lapins a été réalisée à l'aide d'une protéine de fusion constituée de la GST (glutathione-S-transférase) et des acides aminés 592-661 du rClC-3. Les anticorps totaux ont été purifiées par précipitation avec 50% de (NH₄)₂SO₄, puis, les anticorps dirigés contre la GST ont été éliminés par une incubation avec des billes couplées à la GST et les anticorps anti-rClC-3 ont finalement été purifiées sur une colonne d'affinité présentant la protéine de fusion.

J'ai testé la spécificité de ces anticorps, en Western blot, en utilisant des préparations membranaires d'ovocytes contrôles et d'ovocytes exprimant les ClC-3, ClC-4 et ClC-5 de rat. Il apparaît que ces anticorps détectent deux bandes diffuses de masse moléculaires 82 kDa et 110- 120 kDa sur les membranes d'ovocytes exprimant le rClC-3 (Figure 56) (Schmieder et al., 1999). Aucun signal équivalent n'apparaît sur les autres préparations membranaires, ce qui suggère que le signal détecté correspond au rClC-3. De plus, on peut observer une bande plus fine au niveau de 80 kDa qui est présente dans toutes les préparations membranaires y compris celle des ovocytes contrôle. Ce signal correspond donc à la reconnaissance non-spécifique d'une protéine endogène à l'ovocyte de xénope. Nous avons également testé ces anticorps sur les protéines d'amphibien xClC-3 et xClC-5 exprimés dans l'ovocyte. Les anticorps se sont révélées incapables de détecter ces protéines (résultat non illustré). Par conséquent, la bande de 80 kDa

rClC-3 205 116 82 kDa _{contrôle rClC-4 rClC-5}

anticorps

lapin 120

anticorps

lapin 65

B

A

Figure 55: Spécificité des anticorps anti-xClC-3 chez le mammifère. Analyse menée par

Western blot sur des protéines membranaires préparées à partir d'ovocytes contrôle ou exprimant les protéines rClC-3, rClC-4 ou rClC-5. Les protéines ont été séparées par SDS- PAGE (7,5% d'acylamide) et incubées pendant deux heures avec les anticorps anti-xClC-3 du lapin 54 (en A, 1/370ème) et du lapin 120 (en B, 1/20000ème).

205

116

82

Figure 56: Spécificité des anticorps anti-rClC-3

chez le mammifère. Analyse menée par Western blot sur des protéines membranaires préparées à partir d'ovocytes contrôle ou exprimant les protéines rClC-3, rClC-4 ou rClC-5. Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE (7,5% d'acylamide) et incubées pendant deux heures avec les anticorps anti-rClC-3 (à 1,5µg/ml).

rClC-3 rClC-4 rClC-5

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reconnue par les anticorps ne correspondrait, à priori, pas à une protéine de type ClC endogène à l'ovocyte.

Ces anticorps anti-rClC-3 permettent donc de discriminer le rClC-3 parmi les protéines de l'embranchement ClC-3/4/5 chez le rat, mais ne permettent pas l'immunodétection du ClC-3 chez l'amphibien. Ceci s'explique par le degré d'homologie de séquence trop faible entre les ClC- 3 de rat et de xénope (Tableau 14). Du fait des homologies observées entre les différentes protéines de l'embranchement ClC-3/4/5 chez les différentes espèces, il est très probable que la spécificité des anticorps soit identique chez le rat et la souris. En effet, les séquences des ClC-3 de rat et de souris sont identiques à 100% dans la région choisie pour construire la protéine de fusion.

Ces anticorps anti-rClC-3 semblent donc adaptés pour l'étude par Western blot du ClC-3 chez le rat et la souris. Par contre, les expériences d'immunocytochimie pourraient paraître plus délicates du fait de la reconnaissance d'une bande à 80 kDa, correspondant vraisemblablement à une protéine inapparentée aux ClC. Cependant, l'intensité de cette bande reste relativement faible et ce signal n'est pas nécessairement conservé en immunocytochimie.

ClC-3 ClC-4 ClC-5

rat 46/70 49/70

souris 70/70 46/70 49/70

homme 69/70 46/70 49/70

xénope 61/70 ? 48/70

Tableau 14: Identité des acides aminés entre les protéines indiquées et le rClC-3 dans la région

choisie pour la construction de la protéine de fusion GST-rClC-3.