Etude du ClC-3 chez la souris

Etant donné que seuls les anticorps anti-rClC-3 se sont révélés suffisamment spécifiques pour l'étude du ClC-3 sur des tissus naturels, nous avons entrepris la détermination de la distribution tissulaire au niveau protéique, qui n’avait pu être réalisé à ce jour. L’étude a donc été réalisée chez le mammifère.

Distribution tissulaire du mClC-3

La distribution tissulaire du ClC-3 a été examinée chez la souris, par Western blot, avec les anticorps anti-rClC-3. L'expression du ClC-3 au niveau de l'ARNm est élevée dans le système nerveux central (Kawasaki et al., 1994; Borsani et al., 1995). J'ai donc examiné en premier lieu l'expression de la protéine ClC-3 dans le cerveau et le cervelet de souris. Une bande diffuse migrant entre 90 et 110 kDa est révélée sur les deux préparations membranaires (Figure

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57 A). On observe également une bande plus fine à 80 kDa qui rappelle la bande non-

spécifique, de même masse moléculaire, observée dans l'ovocyte de xénope. La préincubation des anticorps, pendant 2-3 heures à température ambiante, avec un excès (30 moles pour 1 mole) de protéine de fusion empêche les anticorps de révéler ces bandes. L'étude s'est ensuite étendue au rein et à l'intestin de souris avec les mêmes anticorps. Des bandes diffuses ont été détectées de 90 à 110 kDa dans le rein (cortex et médulla) et de 100 à 130 kDa dans l'intestin (duodénum, jéjunum et colon) (Figure 57 B).

Etude de la glycosylation du mClC-3

Le mClC-3 a une masse moléculaire calculée d'environ 84 kDa et présente un seul site potentiel de N-glycosylation sur une boucle présumée extracellulaire. Afin de déterminer si la N- glycosylation de la protéine pouvait expliquer les masses moléculaires variables des bandes révélées selon les différents organes, j'ai réalisé des expériences de déglycosylation. Le traitement des préparations membranaires de cerveau, de médulla et de colon par le mélange enzymatique de N-glycosidase F/endoglycosidase F augmente la mobilité électrophoretique des bandes révélées (Figure 58 A). Après déglycosylation, les bandes diffuses migrent, toujours de manière diffuse, au niveau de 80-90 kDa, ce qui est proche de la masse moléculaire calculée pour le mClC-3. La mobilité de la bande fine n'est pas affectée par le traitement déglycosylant. Il semble donc que les bandes diffuses correspondent au mClC-3, alors que la bande fine correspond probablement à la protéine inapparentée également observée sur les ovocytes contrôle. La protéine mClC-3 est donc N-glycosylée dans le système nerveux central, le rein et l'intestin. La migration électrophorétique du mClC-3 glycosylé varie selon les tissus, alors qu'elle est identique pour les mClC-3 déglycosylés. Ceci suggère que les N-glycanes portés par le mClC-3 varient en fonction des tissus.

Le traitement enzymatique associant la neuraminidase et la O-glycosidase permet de cliver les O-glycanes portés par les protéines. L'application de ce traitement aux préparations membranaires de cerveau de souris n'a pas affecté la mobilité électrophorétique du mClC-3 (Figure 58 B). Par conséquent, la protéine mClC-3 ne semble pas faire l'objet d'une O- glycosylation et l'aspect diffus du signal en Western blot ne peut pas être expliqué par une O- glycosylation de la protéine.

Conclusions. Discussion.

Nos résultats (voir aussi Schmieder et al., 1999) montrent que le mClC-3 est exprimé au niveau du système nerveux central, ainsi que dans le rein et l'intestin. Notre étude montre pour la première fois au niveau protéique que le ClC-3 a une large distribution tissulaire chez un mammifère. En accord avec les études antérieures portant sur la distribution tissulaire de l'ARNm du ClC-3, l'expression de la protéine ClC-3 apparaît particulièrement forte au niveau du système nerveux central. Il se pose donc la question du rôle physiologique du ClC-3 dans le système nerveux central.

205

116

82

kDa

47

cerveau

cervelet

cerveau

cervelet

anticorps anti-rClC-3 anticorps anti-rClC-3+ protéine de fusion

205

116

82

duodénumjujénum colon

kDa

205

116

82

kDa

cortex

médulla

A

B

Figure 57: Immunodétection du mClC-3 dans divers organes de souris (A : système

nerveux central, B : rein et intestin). 60 µg de protéines membranaires ont été séparées par SDS-PAGE (7,5% d'acylamide) et incubées pendant 15 heures avec les anticorps anti-rClC-3 (1,5 µg/ml). En A, la protéine de fusion a été utilisée avec un excès de 30 moles pour 1 mole d’anticorps.

207

120

78

kDa

- +

205

116

82

kDa

- +

- +

cortex

duodénum

cerveau

205

116

82

kDa

- +

cerveau

A

B

Figure 58: Etude de la glycosylation du mClC-3 dans divers organes de souris (cerveau,

cortex rénal, duodénum). 100 µg de protéines d'ovocytes exprimant le xClC-3 ont été soumis au traitement déglycosylant au mélange N-glycosidase F/endoglycosidase F (en A) ou bien au traitement déglycosylant à la neuraminidase/O-glycosidase (en B), puis analysés par Western blot. Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE (7,5% d'acrylamide) et incubées 15 heures avec les anticorps anti-rClC-3 (1,5 µg/ml). (-): sans enzyme. (+): avec enzyme.

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Nos résultats suggèrent qu'une N-glycosylation différentielle soit à l'origine de masses moléculaires différentes selon les tissus. Il sera intéressant de déterminer la signification physiologique de l'existence de différentes glycoformes du ClC-3, spécifiques des différents tissus. Des glycoformes différentes peuvent être générées par l'utilisation d'un nombre variable de sites de glycosylation ou bien par l'attachement de glycanes distincts. Comme le mClC-3 ne présente qu'un seul site de glycosylation, seul la deuxième hypothèse est possible. La détermination de la nature des N-glycanes portés permettrait de confirmer cette hypothèse. Il serait également intéressant de déterminer si la glycosylation différentielle est simplement le résultat de capacités de glycosylation distinctes des différents tissus (Williams et al., 1993) ou si elle correspond à une diversité fonctionnelle de la protéine (Shi and Trimmer, 1999). En effet, la glycosylation est une modification post-traductionnelle de la protéine qui aboutit à sa diversification structurale et fonctionnelle (les glycoformes). Divers rôles fonctionnels, tels que l'adressage, la transduction du signal et l'adhésion cellulaire, ont été attribués aux N-glycanes (Rodriguez-Boulan and Powell, 1992; Opdenakker et al., 1993; Matter and Mellman, 1994; Scheiffele et al., 1995; Keller and Simons, 1997; Gut et al., 1998). Ainsi, la N-glycosylation du ClC-3 pourrait moduler sa fonction ou son adressage dans les différents tissus.

La localisation du ClC-3 au niveau cellulaire dans les différents tissus sera un pas déterminant à réaliser dans le cadre de la détermination du rôle physiologique du ClC-3. Elle permettra éventuellement de comprendre la signification physiologique de l'existence de ces différentes glycoformes.

En bref, nous apportons la première étude au niveau protéique de la distribution tissulaire du ClC-3. Chez la souris, le mClC-3 est exprimé dans le système nerveux central, le rein et l'intestin. Cette distribution protéique est en accord avec le profil d'expression très large de son ARNm. La N-glycosylation du mClC-3 semble générer différentes glycoformes selon les tissus. Il sera intéressant de déterminer si cela correspond à une diversité fonctionnelle de la protéine dans les différents tissus.

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