La souche Y2HGold

La souche de levure Y2HGold est commercialisée par Clontech. Cette souche a été utilisée au cours de ce travail de thèse seule et en partenaire de mating de la souche Y187, dans les expériences de double-hybride nucléaire dans le système Matchmaker (Clontech). C’est une souche haploïde, de type sexuel MATa ; auxotrophe pour l’adénine, l’histidine, la leucine et le tryptophane ; délétée pour les gènes GAL4 et GAL80, et qui possède 4 gènes rapporteurs sous

le contrôle de promoteurs répondant au facteur de transcription GAL4, uniquement exprimés lors d’interactions protéine-protéine :

• Le gène AUR1-C, l’allèle mutant dominant du gène AUR1 qui code pour l’enzyme inositol phosphoryl céramide synthase. Son expression dans la levure confère à la levure une forte résistance à l’antifongique Auréobasidine A, qui est un inihibiteur de la synthèse des céramides.

• Le gène HIS3, qui permet à la levure de synthétiser de l’histidine et donc de pousser sur un milieu minimal sans histidine.

• Le gène ADE2, qui permet à la levure de synthétiser de l’adénine et donc de pousser sur un milieu minimal sans adénine.

• Le gène MEL1, qui code pour l’enzyme α-galactosidase capable de cliver le substrat chromogénique X-α-Gal lorsqu’il est présent dans le milieu, donnant une coloration bleue à la colonie.

4 La souche MaV203

La souche de levure MaV203 a été développée par Marc Vidal et est commercialisée par Invitrogen. Cette souche a été utilisée au cours de ce travail de thèse pour les expériences de transactivation de protéine dans le système ProQuest (Invitrogen). C’est une souche haploïde, de type sexuel MATα; auxotrophe pour l’uracile, l’histidine, la leucine et le tryptophane ; délétée pour les gènes GAL4 et GAL80, et qui possède 3 gènes rapporteurs sous le contrôle de

promoteurs répondant au facteur de transcription GAL4, uniquement exprimés lors d’interactions protéine-protéine :

• Le gène HIS3, qui permet à la levure de synthétiser de l’histidine et donc de pousser sur un milieu minimal sans histidine.

• Le gène URA3, qui permet à la levure de synthétiser de l’uracile et donc de pousser sur un milieu minimal sans uracile.

• Le gène LacZ qui code pour l’enzyme β-galactosidase, capable de cliver le substrat chromogénique X-gal lorsqu’il est présent dans le milieu, produisant une coloration bleue de la colonie.

La souche MaV203 possède également les allèles récessifs de résistance à la cycloheximide (cyh2^R) et à la canavinine (can^R) pour la ségrégation des plasmides appâts.

Les vecteurs plasmidiques

Les cartes de ces vecteurs plasmidiques sont données en annexe 3.

1 Le plasmide pGEM-T easy

Le plasmide pGEM-T easy, commercialisé par la société Promega, est un vecteur linéarisé de 3015 pb, utilisé pour le clonage de produits PCR. Ce plasmide haute-copie présente une origine f1 de réplication dans un système bactérien, un gène de résistance à l’ampicilline (100µg/ml) et un site de clonage multiple (polylinker) flanqué par les promoteurs de l’ARN polymérase SP6 et T7. L’avantage de ce plasmide est double : 1) la possibilité d’un clonage TA, chacune des extrêmités 3’ sortantes du vecteur possèdant une thymidine terminale, 2) le polylinker est situé dans le gène LacZ, permettant un crible

blanc/bleu des transformants. Le gène LacZ code pour l’enzyme β-galactosidase, capable de

cliver le substrat chromogénique X-gal lorsqu’il est présent dans le milieu, produisant une coloration bleue. L’inactivation de la β-galactosidase par insertion d’un produit PCR au polylinker produit une coloration blanche de la colonie de bactérie transformée.

2 Les plasmides Gateway

Une grande majorité des clonages au cours de ce travail de thèse ont été réalisés à l’aide de la technologie Gateway (Invitrogen), dans les vecteurs mentionnés ci-dessous. Tous les vecteurs Gateway, exceptés les vecteurs pEG et le vecteur pSTARGATE, sont commercialisés par Invitrogen. Tous les vecteurs Gateway possèdent entre les sites de recombinaison le gène de toxicité ccdB, pour la sélection ultérieure des vecteurs recombinants.

2.1 Les vecteurs donneurs Le vecteur pDONR221

Ce plasmide de 4762 pb présente un gène de résistance à la kanamycine (50µg/ml), et des sites d’hybridation du couple d’amorce universelle M13 de part et d’autre des sites attP pour le séquençage de l’insert.

Le vecteur pCR8/GW/TOPO

Contrairement au vecteur pDONR221, le clonage de fragment d’intérêt dans ce plasmide ne se fait pas par recombinaison BP, mais par un clonage de type TA. Un clonage dans ce vecteur d’entrée permet un gain de temps puisqu’il évite la réaction BP, mais présente l’inconvénient de ne pas être directionnel. Ce plasmide haute-copie de 2817 pb possède des sites attL1 et attL2 flanquants le site de clonage, et des sites d’hybridation des couples d’amorces M13 et GW1/GW2 permettant le séquençage de l’insert. Le plasmide pCR8/GW/TOPO possède un gène de résistance à la spectinomycine (100µg/ml), ainsi qu’un promoteur T7 permettant une transcription in vitro de l’insert.

2.2 Les vecteurs de destination Le vecteur pDEST17

Le vecteur plasmidique pDEST17 (6354 pb) permet la fusion d’une protéine d’intérêt en C-terminale et dans le cadre de lecture d’une étiquette « 6 histidines » (6xHIS). Le plasmide possède un gène de résistance à l’ampicilline (100µg/ml) pour sa sélection en bactérie.

Les vecteurs pDEST32 et pDEST22

Les vecteurs pDEST32 et pDEST22 sont utilisés pour la génération de protéines de fusion GAL4 DBD (GAL4 DNA Binding domain) et GAL4 AD (GAL4 Activation Domain) de protéine d’intérêt, respectivement, pour les expériences de double-hybride nucléaire dans le système ProQuest (Invitrogen). Ces plasmides sont à faible-copie.

Le plasmide pDEST32 (12266 pb) possède un gène de résistance à la gentamycine (50µg/ml ; pour la sélection en bactérie) et un gène d’auxotrophie LEU2 (pour la sélection en levure). Le plasmide pDEST22 (8930 pb) possède un gène de résistance à l’ampicilline (100µg/ml ; pour la sélection en bactérie) et un gène d’auxotrophie TRP1 (pour la sélection en levure).

Les vecteurs pEG101, pEG102 et pEG104

Les vecteurs pEG (pEarleyGate) sont des vecteurs binaires adaptés à la transformation de cellules végétales par A. tumefaciens, developpés par le laboratoire de Craig Pikaard

(http://sites.bio.indiana.edu/~pikaardlab) et décrits dans Earley et al (2006). Les plasmides

pEG possèdent deux origines de réplication, l’une pour E.coli et l’autre pour A.tumefaciens ;

et la région de transfert d’ADN-T par le plasmide Ti d’A.tumefaciens bornée par les bordures

LB (Left Border) et RB (Right Border) responsables de l’intégration d’ADN exogène chez les plantes. Tous les vecteurs pEG utilisés au cours de ce travail de thèse possèdent un gène de résistance à la kanamycine (50µg/ml). Les vecteurs pEG101 et pEG104 permettent l’expression de protéines d’intérêt en fusion N- et C- terminale, respectivement, de la protéine fluorescente YFP (Yellow Fluorescent Protein). Le vecteur pEG102 permet une fusion de la protéine d’intérêt en N-terminale de la protéine fluorescente CFP (Cyan Fluorescent Protein).

Le vecteur pSTARGATE

Le vecteur pSTARGATE a été développé par le CSIRO (Australie) (http://www.pi.csiro.au/rnai/vectors.htm). Ce vecteur est une modification du vecteur pSTARLING, lui-même dérivé du vecteur pHELLSGATE (Wesley et al, 2001), pour une

utilisation dans les plantes monocotylédones et un clonage par le système de recombinaison Gateway. Ce vecteur contient une cassette dessinée pour la production d’ARN double-brin en épingle à cheveu, constituée de :

- un promoteur constitutif suivi d’un intron, issus du gène de l’ubiquitine du maïs - deux sites d’insertion de la séquence d’intérêt en orientation sens et antisens, par

recombinaison homologue (technologie Gateway)

- un intron du gène de la kinase pyruvate déshydrogénase (PDK) d’arabidopsis, permettant le repliement du transgène exprimé en structure en épingle à cheveu - un gène de résistance à l’hygromycine (30µg/ml) sous le contrôle d’un promoteur

fort 35S, pour une sélection des plantes transformées - une séquence terminateur de la nopaline synthase (NOS)

Le vecteur utilisé au cours de ce travail de thèse pour la construction de la cassette RNAi-TaGW2 est lui-même une adaptation du vecteur pSTARGATE. Le vecteur d’origine a été modifié pour permettre la construction d’une cassette RNAi et d’une cassette de sélection indépendantes. L’ensemble « promoteur 35S-gène de résistance à l’hygromycine-terminateur nos » a été retiré et remplacé par une séquence terminateur de l’octopine synthase (OCS).