Exemples de gènes de composantes du rendement en grains isolés et caractérisés chez le riz

Le gène MOC1 (Monococulm 1) est un régulateur clé du nombre de talles chez le riz

(Li et al, 2003 ; Figure 27, A). Ce gène a été isolé dans un crible de mutants de tallage et est

situé sur le bras long du chromosome 6 du riz. Le gène MOC1 code pour un facteur de

transcription de la famille GRAS, spécifique des plantes et contrôle l’initiation et le développement des bourgeons axillaires, à l’origine des talles. Le mutant moc1 présente un plateau de tallage sans talles, causé par un défaut de formation des méristèmes axillaires. La protéine MOC1 contrôlerait également la hauteur de la plante, puisque des plants de riz transgéniques surexprimant le gène MOC1 présentent une taille réduite.

Le gène Gn1a (Grain number 1 a) a été isolé dans un QTL pour le nombre de grains,

sur le chromosome 1 du riz (Ashikari et al, 2005 ; Figure 27, B). Gn1a code pour une

cytokinine oxydase/déshydrogénase (OsCKX2), enzyme qui dégrade la phytohormone cytokinine. Une expression réduite d’OsCKX2 entraîne une accumulation de la cytokinine dans les méristèmes inflorescentiels, augmentant par conséquent le nombre d’organes reproducteurs et donc le rendement en grains, sans affecter la phénologie de la plante.

Les gènes GS3, GIF1, GW5, GS5 et GW2 ont été isolés dans le contrôle de la taille du

grain de riz (Figure 27, C). GS3 (Grain Size 3) a été isolé dans un QTL majeur pour la

longueur et le poids du grain et mineur pour la largeur et l’épaisseur du grain, en région centromérique du chromosome 3 (Fan et al, 2006 ; Figure 27, D). L’allèle favorable de GS3

permet une augmentation du poids du grain de riz de 50%, augmentation majoritairement attribuée à une augmentation de la longueur du grain causée par une augmentation du nombre de cellules sur l’axe longitudinal du grain. Le gène GS3 code pour une protéine

transmembranaire dont la fonction est encore inconnue. GIF1 (GRAIN INCOMPLETE FILLING 1) a été isolé dans un crible de mutants de remplissage du grain de riz et est localisé

sur le chromosome 4 du riz (Wang et al, 2008). Le gène GIF1 code pour une invertase

pariétale nécessaire à la redistribution du carbone au cours de la phase de remplissage du grain. GIF1 est un régulateur positif du remplissage en réserves du grain puisque les grains du

mutant perte-de-fonction gif1 se remplissent moins vite, sont moins remplis et plus friables

par rapport aux grains de variétés sauvages (Figure 27, E). Les granules d’amidon des grains de ces mutants sont anormalement développées et plus lâchement compactées, conduisant à une forte réduction du poids du grain. Le gène GW5 (Grain Weight 5, également appelé qSW5) a été identifié dans un QTL majeur pour le poids et la largeur du grain sur le

puisque des variétés possédant le gène GW5 fonctionnel présentent des diminutions de 16,4%

et 18,7% respectivement de la largeur et du PMG, par rapport aux mutants de délétion ne possédant pas GW5 (Figure 27, F). Les grains des variétés possédant l’allèle mutant

présentent des grains plus lourds du fait d’une augmentation du nombre de cellules dans les glumes qui autorise indirectement une augmentation de la largeur du grain. Le gène GW5

code pour une protéine nucléaire de 144 acides aminés dont la fonction est pour l’instant inconnue. Cependant les auteurs ont montré que la protéine GW5 pouvait interagir physiquement avec des chaînes de polyubiquitine ; et suggèrent que GW5, tout comme GW2, interviendrait dans la régulation de la division cellulaire au cours du développement du grain de riz, via la voie de protéolyse ciblée Ubiquitine-Protéasome 26S. Récemment, le gène GS5

(Grain Size 5) a été identifié dans un QTL majeur pour la largeur, le poids et le remplissage

du grain sur le chromosome 5 du riz (Li et al, 2011). Le gène GS5 code pour une sérine

carboxypeptidase et est un régulateur positif de la taille du grain puisque une augmentation de l’expression de GS5 est positivement corrélée à la largeur du grain (Figure 27, G).

Le gène GW2 (Grain Weight 2) a été isolé dans un QTL majeur pour le poids et la

largeur du grain (Song et al, 2007). Ce travail de thèse ayant pour objet l’analyse

fonctionnelle de l’homologue de GW2 chez le blé tendre, une section détaillée (section 7) est

entièrement consacrée au gène GW2 chez le riz et ses homologues en p.45 de cette synthèse

bibliographique.

Comme nous venons de le voir avec les gènes GW2 et GW5, l’ubiquitination et la voie

de protéolyse ciblée lui étant associée, la voie UPS, constituent une des voies de signalisation régulant des composantes du rendement chez le riz. La voie UPS a largement été décrite, avec les facteurs de transcription et la phosphorylation des protéines, comme une des voies majeures de régulation des processus cellulaires, dans les cellules végétales. Pour ces raisons, au sein de l’équipe Rendement et Adaptation du Blé aux contraintes abiotiques, nous nous intéressons aux mécanismes moléculaires régissant le développement du grain en conditions optimales, et plus particulièrement à la signalisation par l’ubiquitination dans ce contexte scientifique.

Figure 28 : Structure tridimensionnelle de l’ubiquitine (d’après Vierstra, 2009). N : extrêmité N-terminale ; C : extrêmité C-terminale. Les feuillets β sont représentés en vert et les hélices α en bleu. L’ubiquitine possède 7 résidus lysine (en rouge), et une glycine (Gly76) à l’extrêmité C-terminale.

4 L’ubiquitination

L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle réversible qui consiste en la fixation covalente d’une ou de plusieurs protéines d’ubiquitine sur une ou plusieurs lysines acceptrices d’une protéine substrat.

4.1 L’ubiquitine

L’ubiquitine est une protéine de 76 acides aminés (8,5 kDa), présente chez tous les eucaryotes. Elle est extrêmement conservée entre les règnes animaux et végétaux : sa séquence protéique primaire est strictement identique chez tous les végétaux supérieurs et diffère de deux et trois acides aminés chez la levure et les espèces animales, respectivement (Callis et al, 1995). La structure tridimensionnelle de l’ubiquitine est une forme globulaire

très compacte, composée de 5 feuillets bêta formant une cavité au sein de laquelle vient se placer une hélice alpha (Figure 28). De nombreuses liaisons hydrogène intramoléculaires confèrent à l’ubiquitine une remarquable stabilité, sans doute essentielle pour prévenir sa dégradation au cours des cycles d’ubiquitination. L’ubiquitine possède une extrémité C-terminale dépassant de la structure globulaire de la protéine, terminée par une glycine (glycine 76).

L’ubiquitine est codée par la famille multigénique UBQ, composée de 16 gènes chez Arabidopsis thaliana (revue de Smalle et Vierstra, 2004). Les membres de cette famille UBQ

exprime l’ubiquitine soit sous forme de polymères d’ubiquitine (gènes polyUb), dans lesquels

plusieurs unités codantes d’ubiquitine de 228 pb sont organisées en concatémères, soit en fusion N-terminale d’une autre protéine (gènes Ub-fusion). Les gènes polyUb codent pour un

nombre variable de répétition d’ubiquitine concaténées : chez arabidopsis par exemple, il existe des gènes polyUb codant 3, 4, 5 et 6 unités d’ubiquitine à la suite ; chez le tournesol et

le maïs, il existe 2 gènes codant un concaténaire de 6 répétitions d’ubiquitine et 2 gènes de 7 répétitions d’ubiquitine, respectivement. Les gènes Ub-fusion codent pour une ubiquitine en

fusion N-terminale des protéines ribosomales S27a et L40 (Finley et al, 1989 ; Redman et Rechsteiner, 1989). Quelque soit le type de précurseur d’ubiquitine, les monomères d’ubiquitine sont libérés à partir des précurseurs traductionnels par les enzymes déubiquitinases, ou DUB, qui coupent spécifiquement la liaison peptidique qui suit la glycine C-terminale (glycine 76) de chaque monomère d’ubiquitine.

Figure 29 : Représentation schématique simplifiée de la réaction d’ubiquitination (d’après Brooks, 2010). La réaction d’ubiquitination consiste en l’attachement covalent d’une ubiquitine (Ub) sur une protéine cible et nécessite l’intervention séquentielle des enzymes E1, E2 et E3. Suivant une réaction dépendante de l’ATP, l’enzyme E1 active l’ubiquitine (1), puis l’ubiquitine activée est transférée sur l’enzyme E2 (2). L’enzyme E3 reconnaît la protéine à étiqueter, et fixe l’enzyme E2 (3). L’ubiquitine est ensuite soit transférée directement sur la protéine cible (cas de la E3 RING), soit transférée sur l’enzyme E3 avant d’être transférée sur la protéine ciblée (cas de la E3 HECT) (4). Le produit final de cette réaction est la protéine substrat étiquetée avec un monomère d’ubiquitine. Plusieurs cycles réitérés de cette réaction conduisent à l’attachement d’une chaîne d’ubiquitine (polyubiquitination) sur la protéine cible (5). (1) (2) (3) (4) (5) Protéine

cible ^Protéine cible

Protéine

cible ^Protéine cible

Protéine cible Protéine cible (1) (2) (3) (4) (5) Protéine cible Protéine

cible ^{Protéine Protéine} ciblecible

Protéine cible Protéine

cible ^{Protéine Protéine} ciblecible

Protéine cible Protéine cible Protéine cible Protéine cible

Les promoteurs UBQ sont très actifs et ont notamment été exploités pour l’expression de

transgènes chez les céréales.

4.2 La réaction enzymatique d’ubiquitination

La réaction d’ubiquitination fait intervenir successivement 3 enzymes : l’enzyme d’activation de l’ubiquitine, E1 ; l’enzyme de conjugaison E2 et l’enzyme E3 ligase (Figure 29). La réaction commence avec la formation dépendante de l’ATP d’une liaison thioester entre une cystéine de l’enzyme E1 et la glycine 76 de l’ubiquitine. L’ubiquitine ainsi activée est transférée sur une cystéine de l’enzyme E2 par transestérification. De son côté, l’enzyme E3 ligase reconnaît spécifiquement une protéine substrat. L’enzyme E2 se fixe ensuite à l’enzyme E3 et lie soit directement l’ubiquitine sur le groupement amine d’une lysine de la protéine substrat ou transfère l’ubiquitine sur l’enzyme E3 qui catalysera ensuite le transfert de l’ubiquitine sur une lysine de la protéine ciblée. Le produit final de cette réaction est un conjugué protéine substrat-ubiquitine dans lequel le groupement carboxyle de la glycine 76 de l’ubiquitine est liée par une liaison isopeptidique au groupement amine d’une lysine de la protéine substrat.

4.3 Les divers types d’ubiquitination

La protéine substrat peut être ubiquitinée de différentes manières ce qui conditionne son devenir dans la cellule. Une seule ubiquitine ou des chaînes de poly-ubiquitine peuvent être attachées sur un résidu du substrat (mono-ubiquitination et poly-ubiquitination, respectivement) ou des monomères d’ubiquitine sur plusieurs résidus du substrat (multi-mono-ubiquitination), au niveau d'une lysine le plus souvent (revue de Haglund et Dikic, 2005 ; Figure 30). Dans le cas de la ubiquitination, l'élongation de la chaîne de poly-ubiquitine se fait par la formation d'une liaison isopeptidique entre la glycine 76 d'une nouvelle ubiquitine et une lysine de la molécule d'ubiquitine précédemment conjuguée au substrat, par des cycles successifs d’ubiquitination précédemment décrits.

L’ubiquitine contient 7 lysines (K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63 ; Figure 28). Toutes les lysines sont exposées au solvant, et différents types de chaînes poly-ubiquitine peuvent ainsi être formées en fonction de la lysine de l’ubiquitine impliquée dans la liaison avec l’ubiquitine suivante dans la chaîne (revue par Trempe, 2011). Trois natures de chaînes

Figure 30 : Les différentes formes d’ubiquitination et leurs rôles (d’après Haglund et Dikic, 2005). Dans le cas de la poly-ubiquitination, seule le rôle des types de poly-ubiquitination le plus fréquemment rencontré (chaînes d’ubiquitine en K48 et K63) est mentionné.

Mono-ubiquitination

Multi-mono-ubiquitination

Poly-ubiquitination

Dégradation protéique par le protéasome. Réparation de l’ADN, endocytose, activation de protéines kinases. Endocytose. Endocytose,

Régulation des histones, réparation de l’ADN,

export nucléaire, tri endosomal.

Figure 31 : Représentation schématique des différentes possibilités de chaînes d’ubiquitine (d’après Ikeda et

Dikic, 2008). (A) Les chaînes homotypiques sont constituées d’ubiquitine reliées entre elles par une liaison incluant

toujours la même lysine. (B) Les chaînes mixtes présentent des liaisons incluant diverse lysines des ubiquitines et sont bifurquées. (C) Les chaînes hétérologues sont l’assemblage d’ubiquitine et de protéine ubiquitin-like, comme la protéine SUMO 2 (Small Ubiquitin-like Modifier 2) par exemple.

A- Chaînes homotypiques B- Chaîne mixte

C- Chaîne hétérologue

A- Chaînes homotypiques B- Chaîne mixte

peuvent être rencontrées : les chaînes homotypiques, majoritaires dans la cellule, dans lesquelles la même lysine est toujours impliquée dans la liaison entre 2 Ub au sein de la chaîne ; les chaînes hétérotypiques (ou chaînes mixtes) avec des liaisons impliquant différentes lysines et les chaînes hétérologues formées par l’assemblage d’Ub et de protéines Ubiquitin-like (Ikeda et Dikic, 2008 ; Trempe, 2011 ; Figure 31).

Le type de chaîne majoritairement formé est une chaîne d’ubiquitines reliées par la lysine 48 (chaînes K48) et conduit à la fonction la plus connue de l’ubiquitination : la dégradation de protéines par le protéasome 26S (Van Nocker et Vierstra, 1993 ; Trempe, 2011). L’apposition des autres types de chaînes polyUb et la monoubiquitination sont quant à elles impliquées dans des fonctions non-protéolytiques. Les chaînes en lysine 63 (chaînes K63) ont été montrées impliquées dans l’activation d’une protéine kinase humaine, dans la réparation de l’ADN et dans l’endocytose (Weissman, 2001 ; Haglund et Dikic, 2005). Un étiquetage par des chaînes en lysine 11 (chaînes K11) intervient dans le contrôle du cycle cellulaire et dans la voie de dégradation ERAD (Endoplasmic Reticulum-associated Degradation)/Proteasome. Les chaînes en lysine 6 (chaînes K6) ont été décrites dans la réparation de l’ADN (Wu-Baer et al, 2003 ; Sobhian et al, 2007). Bien qu’il ait été montré in vivo la formation des chaînes en lysine 27, 29 et 33 (K27, K29 et K33 respectivement), leur

fonction est encore inconnue (Trempe, 2011). La monoubiquitination conduit à l’endocytose, la réparation de l’ADN, la régulation des histones, le tri endosomal, l’export nucléaire et le bourgeonnement viral Haglund et Dikic, 2005).

Ces différentes étiquettes peuvent ensuite être reconnues par des domaines protéiques appelés UBD (Ubiquitin-Binding Domain). A l’heure actuelle, 9 UBDs différents ont été identifiés (Haglund et Dikic, 2005).

4.4 Les enzymes déubiquitinases (DUBs)

Les DUBs interviennent à plusieurs étapes de la voie d’ubiquitination : elles génèrent d’une part les monomères d’ubiquitine à partir de leur précurseur comme mentionné précédemment, mais recyclent également les monomères d’ubiquitine après dégradation des protéines polyubiquitinées et sont capables d’inverser la réaction d’ubiquitination. Le génome d’Arabidopsis compte 64 gènes de déubiquitinases (Vierstra, 2009).

Figure 32 : Structure tridimensionnelle de protéines Ubiquitin-like (Site internet du Laboratoire de RD

Vierstra). RUB, Related Ubiquitin ; HUB, Homologous to Ubiquitin ; SUMO, Small Ubiquitin-like Modifier ; UFM1,