1. Obtention de protéines recombinantes en phase soluble avant purification
Les protéines totales de cellules COS-7 transfectées, extraites par sonication en solution tampon, en présence de différents détergents, suivie de centrifugations successives (voir Chapitre "B/ Matériels et Méthodes"). Chacune des fractions protéiques obtenues est analysée par Western blot (dépôts de 20 µg de protéines totales/puits) (voir Figure 50). Les anti-peptides entiers correspondants sont utilisés. Certaines fractions ne peuvent être analysées puisque trop peu concentrées en protéines.
En utilisant le CHAPS, pour l’ensemble des fractions obtenues, la majorité des protéines, détectables par les anti-peptides (L4, LN10), se trouvent essentiellement dans les culots de centrifugation (C1 à C2). Les fractions de ‘’Surnageants’’ sont moins concentrées que les fractions ‘’Culots’’. Les fractions issues d'une ultracentrifugation faible (S3, C3) présentent des taux faibles en protéine 12-LOX. Les mêmes observations sont valables avec le Triton X-100.
L’ultracentrifugation (Surnageant S3, culot C3) ne permet pas de récupérer plus de protéines recombinantes 12-lipoxygénase que lors des premières centrifugations. L’essentiel des protéines surexprimées est collecté dans les premières fractions (issues donc des centrifugations 1 et 2). Ces premières fractions permettent de collecter les protéines essentiellement sous forme insoluble (noyaux, membranes cellulaires…).
Le CHAPS et le Triton X-100 restent néanmoins les détergents offrant le meilleur rendement d’extraction de protéines recombinantes. Le déoxycholate de sodium et la Fos Choline 14 ne permettent pas l'obtention de protéines solubles en plus grande quantité. Les rendements sont d'ailleurs plus faibles avec ces deux derniers.
Les protéines recombinantes détectées se trouvent donc sous forme majoritairement insoluble et l’utilisation des divers détergents testés n’a pas permis d’augmenter le rendement de protéines sous forme soluble. Nous continuerons d'utiliser le CHAPS. 2. Purification des protéines recombinantes à queue Poly-Histidine sur colonnes Pierce®
HisPur™
La purification d'extraits de cellules COS-7 transfectées respectivement avec les plasmides 12 LOX L4 et LN10 se fait à l'aide de colonnes de chromatographie d'affinité Pierce®
HisPur™ (Thermofisher) dont la matrice comporte des groupements d'ions cobalt Co2+ à forte affinité avec l'Histidine des Tags protéiques).
Les différentes fractions de 2 ml sont détectées en UV et isolées grâce à un collecteur de fractions (voir Figures 51 Partie A correspondant à la forme courte L4 à gauche, et à la forme normale LN10 à droite).
La purification des protéines recombinantes 12-lipoxygénase sous ses deux formes taguées se traduit par des profils similaires :
(Analyses HPLC de G. Charpigny - UMR BDR, INRA, ENVA, Université Paris Saclay, 78350, Jouy en Josas, France)
Figure 51
Purification des protéines recombinantes 12-lipoxygénase avec tag Histidine. Analysequantité importante de protéines (par comparaison aux fractions suivantes), dont notre protéine d'intérêt.
- Cette "Fraction F1" est suivie d'un "plateau" (Fraction F8 pour L4, F11 pour LN10).
- Les protéines taguées, fixées sur la colonne sont ensuite éluées Le pic correspondant est visible sous la dénomination F9 pour L4 et F12 pour LN10.
- Un plateau final suit la fraction éluée pour chaque purification (F10 pour L4, F13 à F15 pour LN10).
L’évaluation de chaque fraction collectée est faite par Western blot (voir Figure 51 Partie B) en utilisant les immunsérums bruts de lapins 12LOX L4 et 12LOX LN10 respectivement. Seules les fractions indiquées en rouge sur chaque graphique de la Figure 49 Partie A sont analysées par Western blot (10µl de fraction par puits).
Ainsi, pour la forme courte L4 de la 12-lipoxygénase, une majorité de cette forme est détectée dans la Fraction F1 (Figure 49 Partie B, à gauche). La fraction d'élution F9 en comprend mais 10 fois moins. La fraction suivante F10 montre la présence de la protéine 12LOX L4 mais plus faiblement. Ces observations nous indiquent que les protéines recombinantes 12-lipoxygénase de forme courte ne sont pas retenues totalement sur la colonne Agarose/Cobalt Co2+. Une grosse partie d'entre elles passe à travers la colonne sans rétention.
Aucune protéine recombinante de forme courte n'est détectée dans la fraction de lavage, attestant de l'absence de toute protéine taguée résiduelle de la matrice.
Seule la fraction F9 contient la protéine taguée HIS 12-lipoxygénase forme courte L4 sous forme purifiée.
Quant à la forme normale LN10 de la 12-lipoxygénase, une majorité de cette forme est détectée dans le Front F1 (Figure 49 Partie B, à droite). La fraction d'élution F12 en comprend dans les mêmes proportions. Les fractions suivantes F13, F14 montrent la présence de la protéine 12LOX LN10 mais plus faiblement. Le décrochage de la matrice des protéines taguées se fait progressivement en tampon d'élution. La dernière fraction testée (F15) ne montre plus de trace de protéine recombinante LN10 détectable avec l'immunsérum, confirmant alors que toutes les protéines taguées sont totalement détachées de la matrice.
Ces observations nous indiquent que les protéines recombinantes 12-lipoxygénase de forme normale ne sont pas retenues totalement sur la colonne Agarose/Cobalt. Une partie d'entre elles passe à travers la colonne sans rétention.
Seule la fraction F12 contient la protéine taguée HIS 12-lipoxygénase forme normale LN10 sous forme purifiée.
Une deuxième analyse par Western blot est menée sur les fractions de purification de la forme normale de la 12-lipoxygénase recombinante avec un anticorps anti-HIS Tag. La fraction F1, qui contient des protéines 12-lipoxygénase de forme normale LN10 détectée avec l'immunsérum anti-peptide LN10, ne révèle pas de présence de cette même protéine en version taguée poly-HISTIDINE avec l'anticorps anti-HIS Tag. Cela signifie que les protéines 12 LOX LN10 détectées dans le Front F1 ne sont pas taguées.
Pour les fractions F12, F13 et F14, l'essentiel des protéines taguées détectées avec l'anti-HIS Tag se trouve dans la fraction F12 et en moindre quantité dans les deux autres.
Pour conclure, ce dernier test nous permet d'affirmer qu'une majorité de protéines recombinantes 12LOX LN10 se trouve essentiellement sous forme non taguée. Ces
(Analyses HPLC de G. Charpigny - UMR BDR, INRA, ENVA, Université Paris Saclay, 78350, Jouy en Josas, France)
Figure 52 Evaluation de l’activité enzymatique des protéines 12-lipoxygénases
recombinantes (Formes courte L4 et normale LN10, avec/sans Tag Histidine). Mesure du métabolite 12-HETE par Chromatographie HPLC avec détection radioactive sur des extraits de protéines totales de cellules COS-7 transfectées.
L’activité de conversion de l’acide arachidonique en 12-HETE par les protéines recombinantes des formes courte et normale de la 12-lipoxygénase est évaluée sur des extraits de protéines totales de
Ainsi, l'extraction de protéines totales des cellules COS-7 transfectées par le plasmide pCMV LN10 + TAG3 permet de conclure que la construction ne permet pas d'optimiser en l'état la production de protéines taguées, l'essentiel de la production se trouvant non associé à un Tag.