Clonage (par TA Cloning) d'ADNc entiers en vecteur pGEM®-T Easy

Les produits issus de RACE sont insérés dans un vecteur plasmidique (pGEM®-T Easy,

Promega) puis utilisé pour transformer des bactéries compétentes (E. coli DH5α, Life Technologies, Thermofisher) afin de produire ce fragment en grande quantité.

5.1. Le plasmide pGEM®-T Easy

Le choix de ce plasmide est conditionné par 4 paramètres principaux :

- Les amplicons destinés à être clonés subissent, à la fin de la PCR, une étape d’élongation terminale qui ajoute une désoxy-Adénosine aux extrémités 3’ du fragment. Le plasmide

pGEM®-T Easy (Promega) est un vecteur linéaire possédant une désoxy-Thymidine

3’-terminale à chaque extrémité (voir Figures 26 et 27). La complémentarité de ces deux bases permet ainsi le blocage, la recircularisation du plasmide et l’optimisation de l’insertion de produits PCR.

- Ce plasmide possède également le gène de la β-galactosidase qui se scinde lors de l’insertion du produit PCR au sein du plasmide. Il est donc possible de vérifier la correcte ligation de l’amplicon dans le vecteur en recherchant une activité β-galactosidase qui sera présente en absence d’amplicon et absente en présence d’amplicon.

- Ce vecteur est également choisi car il comporte au sein de sa séquence les promoteurs des ARN polymérases T7 et SP6 qui permettront de produire des sondes pour les expérimentations d’hybridation in situ.

- Ce plasmide contient un gène de résistance à l’antibiotique ampicilline (β-lactamase), ce qui permet de sélectionner les colonies bactériennes ayant intégrées le vecteur et de conserver cette pression de sélection au cours de l’expérimentation.

5.2. Ligation de l’amplicon dans le plasmide

Afin que chaque plasmide incorpore un produit de PCR, ce dernier doit être trois fois plus concentré que le plasmide dans le mélange réactionnel (proportion 3 : 1). 50 ng de plasmide sont alors mis en présence de tampon de ligation 1X, de 3 UI de T4 DNA ligase, de la

le vecteur vide. Le mélange est recouvert d’une goutte d’huile pour éviter l’évaporation puis incubé 16 h à +15°C puis 20 min à +65°C afin de dénaturer l’enzyme.

5.3. Transformation bactérienne et culture sur milieu solide des bactéries

2 µl de produits de ligation sont incubés en présence de 50 µL de la solution mère de bactéries E. coli DH5α compétentes (Life Technologies, Thermofisher), mélangés doucement puis incubés 30 min à +4°C. Un choc thermique de 45 sec à +42°C puis de 2 min à +4°C permet la transformation bactérienne. Les bactéries sont ensuite incubées 1 h à 37°C sous agitation (200 tours/minute) dans 950 µl de milieu SOC (tryptone 2 %, extraits de levures 0,5 %, NaCl 10 mM, KCl 2.5 mM, MgCl₂ 10 mM, MgSO₄ 10 mM, glucose 20 mM). 40 µl et 80 µl de chaque population bactérienne, sont déposés sur boîte de Pétri contenant un milieu Luria Bertoni solide et stérile (milieu LB : 1 % de peptone 140, NaCl 1 %, extraits de levures 0,5 %, pH 7.0) avec 1,5 % d’agar et 0.1 µg/ml d’ampicilline (Sigma-Aldrich). 800 µg de X-Gal (Promega) et 800 µg d’IPTG sont préalablement étalés sur les boites. Les cultures sont ensuite incubées la nuit à +37°C à l’obscurité puis conservées à +4°C afin d’accentuer la couleur des colonies bleues.

5.4. Contrôle de la présence de l’insert dans les colonies bactériennes par PCR

Le plasmide possède le gène LacZ qui code pour la β-galactosidase. Cette enzyme hydrolyse le X-gal qui libère ainsi sa partie indolique et forme un précipité bleu par oxydation. Lors de la ligation de l’amplicon dans le vecteur, le gène LacZ est interrompu et la β-galactosidase n’est pas produite. Les colonies qui ont intégré le plasmide avec l’amplicon seront donc blanches tandis que celles qui auront intégré un plasmide vide seront bleues. Seules les colonies ayant intégré le vecteur avec l’amplicon sont conservées dans la suite de l’expérimentation. Les colonies blanches sont prélevées par aspiration avec une pipette et un cône à filtre pour être mises en culture liquide. Lors de cette étape, le cône de la pipette contenant la colonie est trempé préalablement dans un tube contenant les réactifs de PCR. Une PCR est effectuée à l’aide d’amorces encerclant la zone du plasmide où l’amplicon s’est inséré (amorces M13 Sens et Antisens). Si aucun fragment de PCR n’est observé, cela signifie que le plasmide n’a pas été intégré dans les bactéries. Si le produit de PCR M13 obtenu fait 263 paires de bases, le plasmide qui s’est intégré aux bactéries ne contient pas l’amplicon. Enfin, si le produit PCR possède une taille qui correspond à la taille de l’amplicon d’origine additionné de 263 bases, alors le plasmide contenant l’amplicon est bien présent dans les bactéries de la colonie.

5.5. Mise en culture liquide et conservation des clones

Les colonies blanches issues de la culture solide sont prélevées par pipetage avec un cône à filtre et distribuées dans 5 ml de milieu LB contenant 0.1 µg/µl d’ampicilline. L’ensemble est incubé sur la nuit à +37°C sous agitation (200 tours/minute). Un tube témoin contenant le milieu non ensemencé est incubé dans les mêmes conditions. Après incubation, 500 µl de la solution bactérienne sont mélangés à 500 µl d'une solution aqueuse de glycérol 80 %, en cryotube. Ce dernier est congelé dans l’azote liquide et stocké à -80°C.

5.6. Purification des plasmides

Les plasmides restant de la culture sont extraits et purifiés à l'aide du kit Wizard® Plus SV

minipreps DNA purification system (Promega) selon les instructions du fournisseur.

Brièvement, les bactéries sont suspendues dans une solution iso-osmotique et détruites par un tampon de lyse contenant des protéases alcalines et des RNAses. L’ADN libéré est immobilisé sur une colonne d’affinité tandis que les débris cellulaires sont éliminés. Après un