Io est l'intensité du signal en absence d'échantillon (référence) et I est l'intensité après le passage du faisceau dans l'échantillon En VCD, on utilise plutôt la différence
3.3 Soie en solution
Afin de réaliser les expériences sur la soie en solution, il faut dissoudre les échantillons, purifier la solution et la concentrer. Environ 10 mg de protéine est nécessaire pour préparer un échantillon suffisamment concentré pour les expériences VCD et ROA. Le Tableau 3.1 présente un résumé des conditions expérimentales pour la préparation des échantillons. La protéine rMaSpII est étudiée à pH 11 puisqu'elle n'est pas stable à pH plus faible.39 Les
autres protéines sont étudiées en solution dans l'eau ultrapure. Les soies recombinantes rMaSpI et rMaSpII et la soie d'araignée sont dissoutes dans 1 mL d'une solution 6 M de thiocyanate de guanidium (GuSCN) à température pièce pendant 30 minutes. Dans le cas de la soie rMaSpII, la solution est tamponnée à pH 11 dans un tampon phosphate. Puisque le GuSCN n'est pas efficace pour dissoudre la soie de B. mori, le thiocyanate de lithium a été utilisé. Ce sel a été montré comme étant très efficace pour dissoudre cette soie sans la dégrader. La soie est purifiée par chromatographic d'exclusion à l'aide de colonnes PD-10 remplies de gel Sephadex™ G-25 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suède) conditionnée avec 25 mL du tampon désiré. L'éluat est récolté en fractions de 0,5 mL puis testé pour la présence d'ions SCN". Le test permet de détecter la présence de SCN" par la formation d'un complexe avec le Fe3+ qui a une coloration rouge. Les fractions
dont le test a une coloration rouge ou orangée (la solution de FeCl3 est jaune) sont éliminées.
Tableau 3.1 : Conditions expérimentales utilisées pour dissoudre les échantillons de soie
Échantillon Agent dénaturant Solvant
Fibroïne
ver à soie LiSCN saturé (~ 9 M)
Eau ultrapure Fil de survie
araignée GuSCN 6 M Eau ultrapure
rMaSpI
GuSCN 6 M
Eau ultrapure
rMaSpII Tampon pH 11 GuSCN 6 M Tampon pH 11
Les fractions ne contenant pas de sel sont mélangées ensemble, ce qui permet d'avoir généralement 3-3,5 mL de solution. Afin d'avoir une concentration suffisamment élevée pour faire les spectres VCD et ROA, les solutions sont concentrées par centrifugation à 7300 tours par minute en utilisant un filtre Amicon® Ultra (Millipore, Billerica, MA, États-Unis) avec un seuil de rétention de 10 kDa. Ce type de filtre permet de retenir les protéines ayant un poids moléculaire supérieur à 10 kDa alors que les petites molécules comme l'eau et les sels passent au travers. De cette manière il est possible de concentrer les échantillons de soie. Les solutions sont concentrées jusqu'à ce que le volume soit entre 100 et 200 pL. Afin de mesurer la concentration de l'échantillon, une partie de la solution concentrée est diluée, puis sa concentration est calculée à partir de son absorption en spectroscopie UV-Visible en utilisant les coefficients d'absorptivité du Tableau 3.2. Le coefficient d'extinction à 276 nm pour la soie de B. mori a été déterminé par Rôssle et coll.74 Les coefficients d'extinction à 280 nm pour rMaSpI et rMaSpII nous ont été
communiqués par Nexia Biotechnologies Inc. Pour la soie de N. clavipes, le coefficient d'extinction a été calculé à partir des valeurs pour rMaSpI et rMaSpII en considérant qu'elles sont présentes dans un rapport molaire 4 : 1 .
Tableau 3.2 : Coefficients d'extinction des différents échantillons de soie. Échantillon mL.mg"£280 nm 1.cm"1 £276 nm mL.mg" .cm" B. mori - 1,13 N. clavipes 0,594 - rMaSpI 0,55 - rMaSpII 0,77 -
3.3.1 Dichroïsme circulaire vibrationnel
Puisque la bande d'élongation OH de l'eau en infrarouge interfère avec la bande amide I des protéines, les spectres VCD sont faits sur des échantillons dissous dans le D2O. Dans ce cas, au lieu d'avoir une bande amide I on a une bande amide F. Afin de protéger le D2O de la vapeur d'eau contenue dans l'air, l'étape de purification par chromatographic d'exclusion est faite sous une atmosphère d'azote. Les échantillons ont une concentration entre 25 et 35 mg/mL.
Les spectres IR et VCD ont étés enregistrés avec un spectromètre IR Thermo-Nicolet Nexus 670 de ThermoElectron (Madison, WI). Un système optique VCD y a été ajouté afin de pouvoir réaliser des expériences VCD. Pour faire les spectres, on utilise une cellule infrarouge Biocell™ (Biotools Inc., Jupiter, FL) ayant un parcours optique de 45 pm. Chaque spectre correspond à une accumulation de 6000 balayages à une résolution de 4 cm" . Les spectres présentés sont des moyennes d'entre 18 et 20 spectres enregistrés consécutivement sur un même échantillon. Une correction de phase de Haseth, une apodisation Happ-Genzel ainsi qu'une addition de zéros avec un facteur de 1 ont été appliquées sur les spectres.
Les spectres ont été traités à l'aide du logiciel de l'instrument Omnic. La soustraction spectrale du spectre VCD du solvant (D2O) est effectuée sur les spectres de chaque échantillon. Pour les spectres IR, un spectre correspondant à la combinaison linéaire d'un spectre de D2O et d'un spectre de D2O contaminé par du H2O est soustrait. Cela permet de compenser à la fois pour le D2O et pour la légère contamination par le H2O survenant pendant la préparation de l'échantillon. De plus, une ligne de base linéaire multipoint est
appliquée sur les spectres IR et VCD. Afin de compenser pour le fait que les échantillons ont des concentrations légèrement différentes, les spectres VCD sont normalisés par rapport à l'intensité maximale de la bande amide F du spectre infrarouge correspondant.
3.3.2 Activité optique Raman
En Raman la bande d'élongation OH est beaucoup moins active qu'en infrarouge. Par conséquent elle interfère beaucoup moins avec la bande amide I des protéines et l'eau peut être utilisée comme solvant. Comme le Raman est un processus de diffusion, nous ne
sommes pas limités par l'absorbance de l'échantillon, ce qui permet de faire des spectres sur un échantillon plus concentré qu'en spectroscopie infrarouge. Les échantillons qui ont été préparés pour les expériences ROA avaient une concentration entre 70 et 85 mg/mL. Les spectres Raman et ROA ont été enregistrés simultanément avec un spectromètre ROA ChiralRaman™ (Biotools Inc., Jupiter, FL). Le laser a une longueur d'onde de 532 nm et est utilisé à une puissance de 1 W. La résolution spectrale est d'environ 7 cm"1. Les spectres
Raman et ROA ont été enregistrés par tranches d'environ 12 minutes. Le temps d'exposition total est d'environ 16 heures.
Les spectres Raman et ROA ont été traités en utilisant le logiciel OriginPro 8. Les bandes aléatoires provenant des rayons cosmiques frappant le détecteur pendant l'acquisition sont supprimées des spectres Raman et ROA. Les spectres d'une même série d'acquisitions sont moyennes. Les spectres ROA sont lissés à partir d'un filtre FFT à sept points afin de mieux discerner les sommets des bandes. Les spectres sont corrigés avec une ligne de base interpolée spline. Les points sont placés dans des endroits du spectre qui sont dégagés de bandes. Les spectres Raman sont normalisés par rapport à l'intensité maximale de la bande amide I. Les spectres ROA sont normalisés par rapport à l'intensité maximale de la bande amide I du spectre Raman correspondant.