optique vibrationnelle
5.1.2 Agrégation de la protéine rMaSp
La soie rMaSpII sous sa forme agrégée a été étudiée afin de mieux caractériser sa structure. Cette protéine a tendance à former des feuillets P en solution plus rapidement que les autres protéines de soie. La Figure 5.5 montre le spectre IR de rMaSpII avant et après agrégation (durant 4 jours). On voit que le maximum de la bande diminue de 4 cm"1. En même temps, on observe l'apparition de deux bandes attribuées aux feuillets P antiparallèles intermoléculaires (1686 et 1619 cm'1)93. La Figure 5.6 montre le spectre VCD de la protéine rMaSpII à pD 11 avant et après agrégation. Le spectre de rMaSpII agrégée montre que la protéine conserve une proportion importante d'hélices PPII. La bande typique des hélices PPII se trouve à 1629 cm"1, soit 2 cm"1 plus bas que la même bande pour la rMaSpII native. Par conséquent, on peut supposer qu'il y a quelques différences dans les hélices PPII avant et après agrégation. La bande des hélices a se trouve à 1660 cm"1 après agrégation, soit 3 cm"1 plus haut qu'avant agrégation. L'intensité relative par rapport aux autres bandes semble similaire. Ces résultats indiquent que les hélices a ne sont pas converties en feuillets P lors de l'agrégation, mais qu'elles sont affectées par la modification de la structure du reste de la protéine.
1.2- 1 0- | £ 0.8- ro rMaSpII native rMaSpII agrégée 1— i — f 1700 1645 1641 / 1619 / 1650 Nombre d'onde (cm"1) 1600
Figure 5.5 : Spectres IR dans la région amide F de rMaSpII avant et après agrégation (durant 4 jours) à pD 11. Les spectres sont normalisés par la hauteur maximale du spectre.
Deux bandes négatives apparaissent avec l'agrégation. La première a une intensité faible et est centrée à 1688 cm"1. La seconde, d'intensité moyenne, est située à environ 1616 cm"1 et apparaît comme un épaulement de la bande des hélices PPII puisqu'elles sont très près une de l'autre. Les deux bandes sont étroites (environ 6 cm"1 de largeur à mi-hauteur pour la
1 ft\
bande à 1688 cm" ) et sont caractéristiques de feuillets P antiparallèles intermoléculaires. Alors que ces deux bandes deviennent plus intenses, les deux bandes d'hélice PPII diminuent en intensité. Cela indique que ce sont les hélices PPII qui sont converties en feuillets P lors de l'agrégation. Afin de confirmer cette conclusion, il faudrait toutefois enregistrer des spectres à différents états d'agrégation.
2.0- 1.0; £ 0.0+- ro
I -20-
c ^ -3.0 ^ -4.01 -5.0- -6.0- i I i i i 1700 rMaSpII native rMaSpII agrégée 1631 ■ i i i i i i i 1650 Nombre d'onde (cm"1) 1600Figure 5.6 : Spectres VCD dans la région amide F de rMaSpII avant et après agrégation (durant 4 jours) à pD 11.
5.2 Activité optique Raman
La Figure 5.7 montre les spectres Raman et ROA des protéines rMaSpI et rMaSpII dans la région amide III. Ces spectres sont normalisés par rapport à l'intensité à 1650 cm"1 correspond à la bande amide I des protéines. Le spectre ROA de rMaSpI présente une bande négative de faible intensité entre 1252 et 1256 cm"1 ainsi qu'une bande positive de forte intensité à 1314 cm"1. La première bande correspond au maximum de la bande amide III en Raman. Ces deux bandes correspondent à celles retrouvées pour le peptide Acetyl-OOA700-Amide et la P-caséine bovine qui forment des hélices PPII.69'71 Pour la rMaSpII, la bande positive est à une position similaire alors que la bande négative est centrée entre 1254 et 1258 cm"1. Pour les deux protéines, les bandes typiques des hélices a (bande positive intense étroite à 1345 cm"1 et bande négative large d'intensité moyenne vers
15-f 1256 1314 ro E ro a: -i—i—i—r 1150 1200 1300 Nombre d'onde (cm1) ■ i | i i ■ i 1350 1400 73 O > x o
Figure 5.7 : Spectres Raman (moitié inférieure) et ROA (moitié supérieure) dans la région amide III des protéines rMaSpI (non tamponnée) et rMaSpII (tampon pH 11) en solution dans l'eau.
La Figure 5.8 montre les spectres Raman et ROA de la soie d'araignée et de la soie de B. mori en solution dans l'eau. Les spectres ROA présentent une bande négative faible située entre 1261 et 1264 cm"1. Le spectre de la soie d'araignée a une bande positive intense centrée à environs 1315 cm'1. Pour la soie de B. mori, cette bande se situe à 1311 cm' . Ces bandes indiquent que ces deux soies en solution dans l'eau forment des structures PPII. Aucune bande dans les spectres ne suggère la présence d'autre structure. Les hélices a identifiées à partir des spectres VCD ne sont probablement pas observées dans les spectres ROA puisque les bandes sont larges et que la résolution est moindre qu'en VCD.
1263 1311 c ro E 12- 10- 6 - 4 - 2 - 0 - ,1315 N. clavipes B. mori 1150 i i i i i i i i i i i i 1200 1250 1300 Nombre d'onde (cm'1) 73 -1 o --2 1350 1400
Figure 5.8 : Spectres Raman (moitié inférieure) et ROA (moitié supérieure) dans la région amide III de la soie de l'araignée N. clavipes et de B. mori en solution dans l'eau.
Les mesures en ROA permettent de confirmer la structure de la soie en solution. Alors qu'en VCD il est nécessaire d'utiliser le D20 comme solvant, le ROA permet l'utilisation du H20 qui est le solvant naturel pour les protéines de soie. De plus, le ROA permet de faire les mesures à des concentrations plus élevées que le VCD puisqu'il est relié à un phénomène de diffusion et non d'absorption. Ainsi les mesures en ROA ont été réalisées à des concentrations comprises entre 7 et 8 % (masse/volume) alors que celles en VCD ont été réalisées entre 2 et 3 % (masse/volume). Bien que cette concentration soit encore loin de
celle retrouvée dans le réservoir de la glande (entre 30 et 50 %), cela permet de s'y rapprocher.
5.3 Structure de la soie en solution
Les résultats obtenus par VCD et ROA permettent de mieux décrire la structure de la soie en solution. Dans le D20, les quatre échantillons étudiés, soit rMaSpI, rMaSpII, la soie d'araignée et la soie de B. mori, forment tous des hélices PPII en solution. Plus important encore, ils semblent avoir une proportion d'hélices PPII similaire puisque l'intensité de la bande VCD pour cette structure est très proche pour toutes ces protéines après normalisation par rapport à l'intensité dans la bande amide F du spectre IR. Pour rMaSpII la bande des hélices PPII est à plus bas nombre d'onde que rMaSpII et la soie d'araignée à cause de la présence importante de prolines. La position plus élevée de la bande des hélices PPII pour la soie de B. mori (2 cm"1 plus haut que rMaSpI et la soie d'araignée) est certainement due au fait que les hélices PPII sont formées par des segments polyalanineglycine au lieu de polyalanine. La présence d'hélices PPII dans la soie avait déjà été suggérée par Lewis sur la base de la propension des peptides polyalanine à former cette structure secondaire. ' Cela a été prouvé expérimentalement par Lefèvre et coll. à partir des spectres VCD de rMaSpI et rMaSpII.39 Les travaux présentés dans ce mémoire de maîtrise montrent pour la première fois la présence d'hélices PPII directement dans la soie d'araignée et de B. mori solubilisée. En plus des hélices PPII, la soie contient des structures désordonnées bien que les spectres VCD ne permettent pas de les distinguer puisque ces structures ne génèrent pas de signal VCD dans la région amide F. Les protéines rMaSpI et rMaSpII contiennent aussi des hélices a situées dans la partie C-terminales. Bien qu'aucune bande d'hélices a ne soit observée pour la soie d'araignée, il est très probable que cette structure soit présente dans les parties C- et N-terminales par analogie avec les protéines rMaSpI et rMaSpII dont les structures primaires sont inspirées de MaSpI et MaSpII. L'absence de la bande d'hélices a en VCD peut s'expliquer par le fait que les séquences de rMaSpI et rMaSpII sont environ six fois plus courtes que celles de MaSpI et MaSpII.
Bien que les expériences VCD indiquent que la soie forme des hélices PPII en solution dans le D20, cela n'est pas suffisant pour être certain de la structure de la soie in vivo dans les glandes séricigènes. Il a été montré que le D20 favorise davantage la formation des hélices PPII que le H20.113 Comme l'hélice PPII ne forme aucun lien hydrogène intra ou inter chaîne, cette structure est fortement influencée par le solvant. Une des particularités qui fait que l'hélice PPII est influencée par le solvant est qu'elle perturbe moins l'eau que les autres structures secondaires.114 La solvatation d'un soluté a un coût entropique plus élevé pour le D20 que le H20 puisque le D20 forme plus de liens hydrogène par molécule en moyenne.115 Par conséquent, la faible perturbation du solvant causée par les hélices PPII aura un effet plus important dans le D20. Les expériences ROA ont tout de même permis de confirmer que rMaSpI, rMaSpII et la soie d'araignée et de B. mori ont une structure en hélice PPII en solution. Comme le VCD et le ROA ne permettent pas de faire des mesures quantitatives, il n'est toutefois pas possible de vérifier si la même proportion d'hélice PPII et de structures désordonnées est retrouvée dans le D20 et le H20.
PPII
M»rS^7^yHv^
-180 Queue Coikhiii en S Feuillet pi 0 <p«J»g> 180 -• A m pou U ,/' |} i réseï voiiFigure 5.9 : Schéma du processus de filage indiquant la conversion des hélices PPII en brins p lors du filage de la soie.
Les protéines de soie doivent avoir des caractéristiques importantes pour la production de la fibre. D'abord, il est nécessaire que la solution de soie soit stable malgré les variations de
température de l'environnement naturel de l'araignée. Autrement, la soie risquerait d'agréger prématurément dans la glande ce qui risquerait d'empêcher la formation correcte de la fibre de soie. En plus, la solution de soie doit pouvoir former facilement et efficacement les feuillets P lorsque nécessaire. Les hélices PPII conviennent parfaitement à ces critères. Leur structure allongée empêche la formation de liens hydrogène intra-chaînes. La stabilité en solution de cette structure est aussi assurée par la formation de liens hydrogène entre la chaîne principale et l'eau. Ce faisant, cela assure la solubilité nécessaire pour atteindre des concentrations aussi élevées que dans la glande. D'un autre côté, les hélices PPII ont des angles dièdres <D et \|/ près de ceux des brins P antiparallèles tel que représenté à la Figure 5.9. Cela pourrait rendre plus aisée la transition entre les deux structures en abaissant la barrière énergétique. Par conséquent, les polyalanines ou polyalanineglycines formant les hélices PPII peuvent être rapidement converties en feuillets p. Puisque leurs angles dièdres O et v|/ sont proches, on peut considérer l'hélice PPII comme un brin P hydraté. Lors de la déshydratation, l'hélice PPII devient moins stable puisque dans cette structure secondaire est stabilisée par l'hydratation de la chaîne principale. Cet effet combiné aux sollicitations et de la modification de l'environnement chimique entraîne la conversion des hélices PPII en feuillets P antiparallèles. Cette hypothèse est corroborée par les spectres VCD de la rMaSpII avant et après agrégation (Figure 5.6). Sur ces spectres, on voit que la bande des hélices PPII diminue en intensité alors que celles des feuillets P antiparallèles gagnent en intensité lors de l'agrégation.
6.1 Conclusions
Les travaux de recherche présentés dans ce mémoire sont divisés en deux volets. Le premier porte sur l'étude de la deuteration de la soie par spectroscopie infrarouge à réflexion totale atténuée (IR-ATR) et le second porte sur l'étude de la soie en solution par spectroscopie de dichroïsme circulaire vibrationnel (VCD) et par spectroscopie d'activité optique Raman (ROA). Ces travaux permettent de mieux définir la structure des fibres de soie et de la soie en solution, en plus de mieux comprendre les relations entre la structure et les propriétés de la soie.
La soie de la glande ampullacée majeure de l'araignée Nephila clavipes et la soie du ver à soie Bombyx mori ont été étudiées par spectroscopie IR-ATR. Afin de bien différencier les structures amorphes, qui n'ont pas d'orientation préférentielle, des feuillets P, qui sont orientés suivant l'axe de la fibre, l'échantillon a été tourné par rapport au champ électrique du faisceau infrarouge. Les échantillons ont été deutérés afin de bien déterminer la signature spectrale des feuillets P cristallins puisqu'ils ne sont pas accessibles à l'eau. Les spectres de la soie d'araignée et de B. mori avant et après deuteration ont permis d'identifier trois structures différentes dans la soie, les structures amorphes, les feuillets P cristallins et l'interphase. Cette interphase est constituée de feuillets P et assure la transition entre les deux autres structures.
La décomposition spectrale de la région amide II des spectres de soie d'araignée et de B. mori a permis de déterminer la proportion et l'orientation de chaque phase. La soie d'araignée est composée de 5 4 % de structures amorphes, 2 7 % d'interphase et 19% de feuillets P cristallins. La soie de B. mori est composée de 50 % de structures amorphes, 8 % d'interphase et 42 % de feuillets P cristallins. Pour les deux soies, les structures amorphes sont peu orientées alors que les feuillets P cristallins et l'interphase sont orientés suivant l'axe de la fibre. Ces résultats ont permis de proposer un modèle structural pour la soie.
Dans ce modèle, l'interphase est située aux extrémités des feuillets P cristallins et les relie aux structures amorphes. Le plus grand volume d'interphase pour la soie d'araignée par rapport à la soie de B. mori pourrait expliquer ses meilleures propriétés mécaniques.9'76
Le VCD a permis de déterminer que les protéines de soie recombinante rMaSpI et rMaSpII ainsi que la soie d'araignée et du ver à soie forment principalement des hélices PPII en solution dans le D20. Les protéines rMaSpI et rMaSpII forment aussi un peu d'hélices a, situées probablement dans la partie C-terminales, Il est probable que la soie d'araignée possède aussi des hélices a en solution dans les parties terminales, mais qu'elles ne soient pas observées puisque la partie répétitive des protéines MaSpI et MaSpII sont environ six fois plus longues que celles de rMaSpI et rMaSpII alors que les segments C-terminaux sont les mêmes. Le ROA a permis de prouver que ces quatre protéines forment des hélices PPII dans le H20 qui est le solvant naturel de la soie dans la glande. Les hélices PPII pourraient avoir d'importantes répercussions pour le processus de filage puisque cette structure secondaire est stabilisée par des liaisons hydrogène avec l'eau en solution. De plus, comme les angles dièdres O et *F qui la définissent sont proches de ceux des feuillets P antiparallèles, la transition entre les deux structures à la fin du conduit de la glande est favorisée. Par ailleurs, les spectres VCD de rMaSpII avant et après agrégation indiquent que ce sont les hélices PPII qui se convertissent en feuillets P antiparallèles.
6.2 Perspectives
Les travaux présentés dans le cadre de ce mémoire de maîtrise peuvent être continués de diverses manières. L'étude de la deuteration d'autres soies permettrait de confirmer les travaux présentés au Chapitre 4. La corrélation entre le pourcentage de feuillets p qui ne se deutèrent pas avec le pourcentage de cristallinité pourraient être vérifiée en étudiant par exemple la soie ampullacée majeure des araignées Argiope aurentia et Araneus diadematus et la soie du ver à soie sauvage Antheraeapernyi. L'étude de la soie produite par les autres glandes de l'araignée, comme la glande ampullacée mineure, de la glande aciniforme et la glande flagelliforme serait intéressante. La relation entre la proportion des trois phases
(amorphe, cristalline et interphase) et les propriétés mécaniques pourrai aussi être confirmée.
L'étude de films de soie régénérés pourrait bénéficier de la méthodologie présentée au Chapitre 4. La soie régénérée a en effet plusieurs applications potentielles, notamment dans le domaine biomédical pour la fabrication d'échafaudages moléculaires pour l'ingénierie tissulaire. Comme les propriétés mécaniques ainsi que la vitesse de dégradation dépendent de la quantité de feuillets P, il serait intéressant de déterminer les pourcentages de structures amorphes, de feuillets P cristallins et de feuillets P interfaciaux. Ces travaux pourraient permettre de relier la méthode de préparation des films de soie régénérés à la structure du film ainsi qu'aux propriétés mécaniques.
Des travaux préliminaires ont été entrepris sur ce dernier point. La soie a été dissoute et purifiée suivant le protocole présenté au Chapitre 3 pour l'étude de la soie en solution. La solution obtenue après purification a été placée sur un pétri et laissée à sécher pendant la nuit. Le film a été étiré à 376 % à une vitesse de 0,093 mm/s à une humidité relative de 95 %. Avant étirement, la soie n'a pas d'orientation préférentielle et est essentiellement constituée de structures amorphes. Les spectres IR-ATR de la soie régénérée parallèle et perpendiculaire au champ électrique sont montrés à la Figure 6.1. Les spectres ont aussi été enregistrés après deuteration, ce qui a permis de bien déterminer les paramètres pour la décomposition spectrale. Selon les résultats obtenus, la soie régénérée dans le film étiré de 376 % serait formée de 71 % de structures amorphes, de 18 % de feuillets P cristallins et 11 % de feuillets P interfaciaux.
0.0060- 0.0050- 0.0040- 0.0000- 1627 1517 • Spectre 90° Spectre 0' ■ i i i i i i i i i i i i i 1700 1650 1600 1550 ■ I i i i i I i i i i 1500 1450 1400 1350 Nombre d'onde (cm'1)
Figure 6.1 Spectres IR-ATR d'un film de soie régénéré étiré à 376 % de sa longueur initiale placé parallèlement et perpendiculaire au champ électrique du faisceau infrarouge.
Afin de compléter les travaux présentés sur l'étude de la soie en solution, il serait intéressant d'enregistrer des spectres de la soie extraite de la glande. Comme il est possible de travailler sur des échantillons en solution aqueuse sans limites de concentration, la spectroscopie ROA est toute désignée. Cela permettrait de connaître la structure de la soie dans les mêmes conditions que celles retrouvées dans la glande. L'étude des films de soie régénérés par la spectroscopie VCD serait intéressante puisque cette technique pourrait nous informer davantage sur la structure de la soie régénérée avant et après agrégation. Ce faisant, cela permettrait de mieux connaître le processus de filage naturel.
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