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Étude de la structure de fibres de soie et de la soie en solution par spectroscopie vibrationnelle

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Academic year: 2021

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(1)

ETUDE DE LA STRUCTURE DE FIBRES DE SOIE ET

DE LA SOIE EN SOLUTION PAR SPECTROSCOPIE

VIBRATIONNELLE

Mémoire présenté

à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l'Université Laval dans le cadre du programme de maîtrise en chimie

pour l'obtention du grade de Maître es sciences (M.Sc.)

DEPARTEMENT DE CHIMIE FACULTÉ DES SCIENCES ET DE GÉNIE

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2012

(2)
(3)

Les travaux présentés portent sur l'étude de la structure moléculaire des fibres de soie et de la soie en solution. La spectroscopie infrarouge à réflexion totale atténuée a permis d'étudier la deutération de la soie de l'araignée Nephila clavipes et du ver à soie Bombyx mori. Nous avons pu identifier la présence de structures amorphes, de feuillets P cristallins et de feuillets p interfaciaux dans les deux fibres en plus de calculer leurs proportions et leur orientation.

Le dichroïsme circulaire vibrationnel et l'activité optique Raman ont été utilisés pour étudier la structure secondaire de la soie en solution puisque ces techniques sont très sensibles à la conformation des protéines. Les spectres des protéines recombinantes rMaSpI et rMaSpII, analogues aux protéines de la soie d'araignée, et de la soie d'araignée et de Bombyx mori indiquent que la soie forme des hélices 3i en solution dans l'eau et dans l'eau lourde.

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Abstract

The presented work concerns the study of the molecular structure of silk fibers and silk in solution. Attenuated total reflection infrared spectroscopy allowed studying the silk of the spider Nephila clavipes and the silk of the silkworm Bombyx mori before and after deuteration. We have been able to identify the presence of amorphous structures, crystalline P-sheets and interphase P-sheets and to calculate their proportions and orientation.

Vibrational circular dichroism and Raman optical activity have been used to study the secondary structure of silk in solution since these techniques are very sensitive to protein conformation. The spectra of the recombinant proteins rMaSpI, rMaSpII (analogous to spider silk proteins), spider silk and silkworm silk indicate that silk forms 3i helices in water and heavy water.

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Le Chapitre 4 a été accepté pour publication dans le journal Soft Matter (Paquet-Mercier, F; Lefèvre, T; Auger, M. et Pézolet, M, Soft Matter, 2012, accepté pour publication; DOI: 10.1039/C2SM26657A). Il porte sur l'étude de la deutération de la soie de l'araignée Nephila clavipes et du ver à soie Bombyx mori par spectroscopic infrarouge à réflexion totale atténuée (IR-ATR). Cet article a été accepté avec révisions majeures et est en révision. Ma contribution a consisté à préparer les échantillons, établir la méthodologie, faire les mesures de spectroscopic IR-ATR, interpréter les données et rédiger l'article. Thierry Lefèvre, second auteur m'a aidé pour l'analyse et l'interprétation des données, et la rédaction.

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Je tiens d'abord à remercier mon codirecteur de recherche, Michel Pézolet, qui m'a permis de découvrir le milieu passionnant de la recherche en m'acceptant comme stagiaire dans son laboratoire après ma première année de baccalauréat. Je remercie aussi ma directrice de recherche, Michèle Auger, qui a accepté de me prendre comme étudiant à la maîtrise. Merci à vous deux de m'avoir fait confiance tout au long de ma maîtrise. Je tiens aussi à remercier Thierry Buffeteau de l'Université Bordeaux I qui m'a accueilli dans son groupe de recherche à l'Institut des sciences moléculaire pendant un mois.

Merci à Thierry Lefèvre pour son aide précieuse tout au long de mon projet de recherche. Merci de m'avoir appris les bases sur la soie et la spectroscopic vibrationnelle lorsque j'ai commencé mon premier stage en laboratoire et d'avoir continué par la suite à me partager tes connaissances. Je voudrais aussi remercier Maxime Boulet-Audet de m'avoir montré à manipuler le dispositif pour la rotation d'échantillon utilisé pour les expériences en spectroscopic infrarouge à réflexion totale atténuée et à analyser les résultats.

Merci à Jean-François Rioux-Dubé de s'être occupé des appareils afin qu'ils soient en bonne condition. Merci de m'avoir montré à utiliser les spectromètres. Merci à Nicolas Daugey de l'Institut des sciences moléculaires à l'Université Bordeaux I pour son aide pour les mesures d'activité optique Raman.

Je tiens à remercier tous les membres des groupes Pézolet et Auger que j'ai côtoyés pendant mes études d'avoir su créer une atmosphère agréable au laboratoire. Merci aux étudiants de l'Institut des sciences moléculaires à l'Université Bordeaux I de m'avoir intégré pendant mon court séjour d'un mois et d'avoir rendu celui-ci agréable.

Finalement, je tiens à remercier ma famille ainsi que ma copine, Magali, pour le soutien moral pendant toute la durée de ma maîtrise.

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Résumé i Abstract ii Avant-propos iii Remerciements iv Table des matières v Liste des tableaux vii Liste des figures viii

Liste des abréviations x Liste des symboles xi Chapitre 1 : Propriétés mécaniques et structure de la soie 1

1.1 Propriétés mécaniques 1 1.2 Structure de la soie d'araignée 2

1.2.1 Structures microscopique et nanoscopique 2

1.2.2 Structures secondaires 4 1.2.3 Structure primaire de la soie 7 1.3 Structure de la soie de Bombyx mori 9

1.3.1 Structure microscopique et nanoscopique 9

1.3.2 Structures secondaires 10 1.3.3 Structure primaire et structure secondaire locale 10

1.4 Protéines recombinantes rMaSpI etrMaSpII 11

1.5 Structure de la soie en solution 13 1.6 Processus de filage 14

1.6.1 Glande de l'araignée Nephila clavipes 14 1.6.2 Glande du ver à soie Bombyx mori 17

1.7 Objectifs du projet 18 Chapitre 2 : Techniques utilisées 20

2.1 Spectroscopic infrarouge à réflexion totale atténuée (IR-ATR) 20 2.1.1 Orientation moléculaire et pourcentage de structures 21

2.1.2 Dispositif pour la rotation de l'échantillon 22

2.2 Activité optique vibrationnelle 23 2.2.1 Dichroïsme circulaire vibrationnel 24

2.2.1.1 Spectroscopic de dichroïsme circulaire vibrationnel 24 2.2.1.2 Spectromètre de dichroïsme circulaire vibrationnel 26 2.2.1.3 Spectres de dichroïsme circulaire vibrationnel théoriques pour les différentes

structures secondaires dans le D20 27 2.2.2 Activité optique Raman (ROA) 28

2.2.2.1 Spectroscopic d'activité optique Raman 28 2.2.2.2 Spectromètre d'activité optique Raman en configuration SCP 30

2.2.2.3 Spectre d'activité optique Raman typiques pour les différentes structures

secondaires 32 Chapitre 3 : Matériel et méthodes 35

3.1 Préparation des échantillons de soie d'araignée 35 3.2 Préparation des échantillons de soie de B. mori 35

(8)

3.3.1 Dichroïsme circulaire vibrationnel 38

3.3.2 Activité optique Raman 39 Chapitre 4 : Evidences by infrared spectroscopy of the presence of two types of P-sheets in

major ampullate spider silk and silkworm silk 40

4.1 Résumé 40 4.2 Abstract 41 4.3 Introduction 41 4.4 Experimental section 43

4.4.1 B. mori sample preparation 43 4.4.2 N. clavipes sample preparation 44 4.4.3 Spectral acquisition and treatment 44

4.4.4 Spectral decomposition 45 4.5 Results and discussion 47

4.6 Conclusion 60 Chapitre 5 : Étude de la soie en solution par activité optique vibrationnelle 61

5.1 Dichroïsme circulaire vibrationnel 61 5.1.2 Agrégation de la protéine rMaSpII 66

5.2 Activité optique Raman 68 5.3 Structure de la soie en solution 71

Chapitre 6 : Conclusions et perspectives 74

6.1 Conclusions 74 6.2 Perspectives 75 Bibliographie 78

(9)

Tableau 3.1 : Conditions expérimentales utilisées pour dissoudre les échantillons de soie. 37

Tableau 3.2 : Coefficients d'extinction des différents échantillons de soie 38

Table 4.1 Assignment of the observed bands in the experimental spectra of B. mori N.

clavipes MA silk 50 Table 4.2 : Components of the amide I and amide II bands, order parameter < P2 >, and

P-sheet content as obtained from spectral decomposition 55 Tableau 5.1 : Position des bandes observées sur les spectres IR et VCD dans la région

amide l'de rMaSpI, rMaSpII (pD 11) et de la soie d'araignée et de B. mori en solution

(10)

Figure 1.1 : Courbe contrainte-élongation de la soie de la glande ampullacée majeure de l'araignée Nephila edulis et de la fibrome du ver à soie Bombyx mori. Modifiée à

partir de Shao et Vollrath.1 2

Figure 1.2 : Structure de la section transversale de la soie de l'araignée Argiope trifasciata

au point de fracture. Tirée de Poza et coll.3 3

Figure 1.3 : Lien amide entre deux acides aminés avec les angles dièdres O et T 4

Figure 1.4 : Diagramme de Ramachandran. Source Institute for Biocomputation and

Physics of Complex Systems }Q 5

Figure 1.5 : Structures secondaires pour un peptide polyalanine. A) hélice a, B) hélice PPII,

Q b r i n p 6 Figure 1.6 : Structure primaire simplifiée de la soie de l'araignée N. clavipes. Modifiée à

partir de Hinman et coll.19 8

Figure 1.7 : Structure de la section transversale des deux brins de fibroïne avec la séricine

du ver à soie B. mori au point de fracture. Tirée de Poza coll 10 Figure 1.8 Structure primaire simplifiée de la protéine chaîne lourde de la fibroïne de B.

mori. Modifiée à partir de Mita et coll 11 Figure 1.9 : Image de la glande ampullacée majeure de l'araignée N. clavipes dégagée des

tissus environnants. Modifiée à partir de Lefèvre et coll.44 15

Figure 1.10: Schéma de la glande du ver à soie. Les abréviations sont les suivantes, A : glande antérieure ; AM : section antérieure de la glande du moyenne ; MM : milieu de la glande moyenne ; PM : section postérieure de la glande moyenne ; P : glande

postérieure. Tirée de Gamo et coll 18 Figure 2.1 : Dispositif permettant la rotation de l'échantillon montrant la roue graduée (A),

le support (B), la tige (Z) et la butée (F). Modifiée à partir de Boulet-Audet et coll.2123 Figure 2.2 : Transitions vibrationnelles avec la lumière polarisée circulairement vers la

gauche et vers la droite. Modifiée à partir de Nafie.57 25

Figure 2.3 : Schéma du spectromètre VCD 26 Figure 2.4 : Spectres VCD obtenus par simulation spectrale des principales structures

secondaires des protéines dans le D2O. Thierry Buffeteau, Université Bordeaux I,

2006, résultats non publiés 27 Figure 2.5 : Transition vibrationnelle en activité optique Raman avec la configuration SCP

(scattered circular polarisation - diffusion polarisée circulairement). Excitation avec la lumière polarisée linéairement et détection de la lumière diffusée polarisée

circulairement. Modifiée à partir de Nafie.57 29

Figure 2.6 : Schéma du spectromètre SCP-ROA. Modifiée à partir de Nafie.67 31 Figure 2.7 : Spectres Raman (ID + IG) et ROA (ID - IG) de (A) albumine de sérum humain

(hélices a), (B) immunoglobuline humaine (feuillets P), (C) P-caséine bovine (PPII).

Modifiée à partir de Zhu et coll.69 33

Figure 2.8 : Spectres Raman (ID + IG) et ROA (ID - IG) du peptide

Acetyl-OOAAAAAAAOO-Amide (O = ornithine) à pH 4,6 et du poly-L-glutamate à pH 12,6

adoptant la structure PPII dans l'eau. Modifiée à partir de McColl et coll.71 34 Figure 4.1 : ATR infrared spectra of B. mori silk before and after deuteration. A)

(11)

while the other spectra are normalized following the procedure described in the Experimental section. The black trace represents the difference between the spectra of

the non deuterated fiber and the deuterated one 49 Figure 4.2 : ATR infrared spectra of MA silk before and after deuteration. A) 0°-spectra B)

90°-spectra. Real absorbance for the 0°-spectrum before deuteration while the other spectra are normalized following the procedure described in the experimental section. The black trace represents the difference between the spectra of the non deuterated

fiber and the deuterated one 51 Figure 4.3 : Spectral decomposition of the ATR infrared spectra of B. mori silk. A) Fiber

perpendicular to the fiber axis. B) Fiber parallel to the fiber axis 52 Figure 4.4 : Spectral decomposition of the ATR infrared spectra of MA silk. A) Fiber

perpendicular to the fiber axis. B) Fiber parallel to the fiber axis 53 Figure 4.5 : Three-phase model for the MA and B. mori silk. For MA silk (A) and B. mori

silk (B), the area of the blue (crystals) and orange (interphase) rectangles are scaled with respect to the proportion of crystalline and interphase p-sheets, respectively. The length and width of the crystals are scaled with respect to the crystal sizes determined

by X-ray scattering.8,20 59

Figure 5.1 : Spectres infrarouge dans la région amide F de solutions de rMaSpI, rMaSpII, soie d'araignée et B. mori dans le D2O, préparées suivant les conditions décrites au

Chapitre 3 62 Figure 5.2 : Spectres VCD dans la région amide T de solutions de rMaSpI (non tamponné)

et de rMaSpII (tampon pD 11) dans le D2O, préparées dans les conditions décrites au

Chapitre 3 63 Figure 5.3 : Spectre VCD dans la région amide l'de la soie d'araignée en solution dans le

D20 64

Figure 5.4 : Spectre VCD dans la région amide I' de la soie de B. mori en solution dans le

D20 65

Figure 5.5 : Spectres IR dans la région amide V de rMaSpII avant et après agrégation (durant 4 jours) à pD 11. Les spectres sont normalisés par la hauteur maximale du

spectre 67 Figure 5.6 : Spectres VCD dans la région amide V de rMaSpII avant et après agrégation

(durant 4 jours) àpD 11 68 Figure 5.7 : Spectres Raman (moitié inférieure) et ROA (moitié supérieure) dans la région

amide III des protéines rMaSpI (non tamponnée) et rMaSpII (tampon pH 11 ) en

solution dans l'eau 69 Figure 5.8 : Spectres Raman (moitié inférieure) et ROA (moitié supérieure) dans la région

amide III de la soie de l'araignée N. clavipes et de B. mori en solution dans l'eau 70 Figure 5.9 : Schéma du processus de filage indiquant la conversion des hélices PPII en

(12)

A ou Ala ADN ATR Asn B. mori CCD ECD E. coli G ou Gly GuSCN ICP-ROA IR L ou Leu LiSCN MaSpI MaSpII N. clavipes O P ou Pro PCD PCG PEM PPII Q ou Gin Rou Arg ROA REDOR rMaSpI rMaSpII RMN ou NMR S ou Ser SCP-ROA Soie MA T ou Tyr VCD ' XAO Alanine Acide désoxyribonucléique

Attenuated total reflection - Réflexion totale atténuée Asparagine

Bombyx mori

Charged coupled device

Electronic circular dichroism - Dichroïsme circulaire électronique

Escherichia coli

Glycine

Thiocyanate de guanidium

Incident circular polarization Raman optical activity - activité optique Raman avec lumière incidente polarisée circulairement Infrarouge

Leucine

Thiocyanate de lithium

Première spidroïne de la glande ampullacée majeure Seconde spidroïne de la glande ampullacée majeure

Nephila clavipes

Acide aminé non-naturel ornithine Proline

Lumière polarisée circulairement à droite Lumière polarisée circulairement à gauche Modulateur photoélastique

Hélice de type polyproline II Glutamine

Arginine

Raman optical activity - Activité optique raman

Rotational echo double resonance

Protéine recombinante basée sur la séquence de MaSpI Protéine recombinante basée sur la séquence de MaSpII Résonnance magnétique nucléaire

Serine

Scattered circular polarization Raman optical activity - activité optique Raman avec diffusion polarisée circulairement

Soie de la glande ampullacée majeure de l'araignée Tyrosine

Vibrational circular dichroism - Dichroïsme circulaire vibrationnel Peptide Acetyl-XXAAAAAAAOO-Amide où X et O désignent les acides aminés non-naturel acide diaminobutyrique et ornithine, respectivement

(13)

A Absorbance

A D Absorbance pour la lumière polarisée circulairement à droite A Q Absorbance pour la lumière polarisée circulairement à gauche Ao Absorbance indépendante de l'orientation

Ai Absorbance lorsque l'échantillon est parallèle au champ électrique AL Absorbance lorsque l'échantillon est perpendiculaire au champ

électrique 13C Carbone 13 D Deuterium dp Profondeur de pénétration AI Différence d'intensité AA Différence d'absorbance E Nombre d'Euler

E Module de Young ou amplitude du champ électrique Eo Amplitude initiale du champ électrique

e Déformation ou coefficient d'absorption EMax Déformation à la rupture

H Hydrogène

/ Intensité du signal après le passage du faisceau dans l'échantillon Io Intensité du signal en absence d'échantillon

ID Intensité de la lumière diffusée polarisée circulairement à droite IQ Intensité de la lumière diffusée polarisée circulairement à gauche

K+ Ion potassium

/ longueur de l'échantillon

lo Longueur initiale de l'échantillon X Longueur d'onde

no Niveau électronique fondamental

ni Indice de réfraction du premier milieu ou premier niveau électronique excité

«2 Indice de réfraction du second milieu vo Niveau vibrationnel fondamental v/ Premier niveau vibrationnel excité

Na+ Ion sodium

P Lumière polarisée linéairement parallèlement au plan d'incidence P2 Paramètre d'ordre de degré 2

R Rapport dichroïque

S Lumière polarisée linéairement perpendiculairement au plan d'incidence

a Contrainte o"Max Contrainte à la rupture

dc Angle critique pour la réflexion totale interne COF Fréquence de Fourier

(14)
(15)

1.1 Propriétés mécaniques

Pour déterminer les propriétés mécaniques d'un matériau, on mesure généralement la contrainte en fonction de 1'elongation. La contrainte cr exprimée en GPa représente la force normalisée par l'aire de la section transversale qu'il faut appliquer sur un matériau pour le déformer. La déformation s est l'allongement de la longueur / de l'échantillon lors de la traction normalisée par rapport à la longueur initiale IQ.

s =

v^o j Éq. 1.1

L'aire sous la courbe de la contrainte en fonction de l'élongation donne l'énergie à la rupture du matériau exprimée en J i m . Dans la zone de déformation élastique, la contrainte varie linéairement avec la déformation, suivant la loi de Hooke cr = E s . La pente dans cette zone est le module de Young, E . La contrainte, l'élongation et l'énergie à la rupture ainsi que le module de Young sont les paramètres couramment utilisés pour caractériser les propriétés mécaniques des matériaux.

Les propriétés mécaniques de la soie d'araignée sont meilleures que celles de la soie du ver à soie tel qu'illustré à la Figure 1.1, sa contrainte et son elongation à la rupture étant plus élevées. L'aire sous la courbe pour la soie d'araignée est aussi plus grande, donc elle dissipe plus d'énergie avant de se rompre. De plus, leurs zones de déformation élastique et plastique ont des formes différentes ce qui laisse supposer qu'elles réagissent différemment à la contrainte appliquée.

(16)

Soie de ver à soie OM«=0,6GPa 0.15 0.25 Elongation — i — » 0.35

Figure 1.1 : Courbe contrainte-élongation de la soie de la glande ampullacée majeure de l'araignée Nephila edulis et de la fibroïne du ver à soie Bombyx mori. Modifiée à partir de ShaoetVollrath.1

1.2 Structure de la soie d'araignée

La soie a une organisation structurale très hiérarchisée. Différentes études ont été réalisées pour bien comprendre l'origine des propriétés mécaniques de la soie et mieux connaître la structure de la soie à différentes échelles. Cette section présente la structure de la soie en commençant par sa structure microscopique pour terminer par sa séquence en acides aminés, en passant par la structure secondaire et la structure nanoscopique.

1.2.1 Structures microscopique et nanoscopique

La microscopie à force atomique a permis de mettre en évidence que la soie a une structure de type coeur-coquille avec une coquille mince.2 La microscopie électronique à balayage

(17)

soit plus orientée et contienne plus de feuillets p que l'intérieur.4' 5 La soie filée à une

vitesse plus élevée aura un effet cœur-coquille moins important qu'une soie filée à faible vitesse.5 L'intérieur du cœur est constitué de microfibrilles d'au moins 170nm de long

orientées suivant l'axe de la fibre. ' ' Une autre étude utilisant la microscopie à force atomique d'une coupe longitudinale de la soie indique toutefois qu'il n'y a pas présence de microfibrilles, mais plutôt de structures globulaires sans orientation préférentielle.7

À une plus faible échelle, la diffraction des rayons X permet d'observer des nanocristaux de feuillets P faisant 5 x 2 * 7 nm orientés suivant l'axe de la fibre. La cristallinité de la soie est d'environ 12 %. La soie est aussi composée à 34 % de structures non cristallines

o

orientées et 54 % de structures non cristallines sans orientation. La présence des cristaux joue un rôle important dans les propriétés mécaniques de la soie puisque les cristaux

confèrent de la rigidité à la soie alors que les régions amorphes lui confèrent son élasticité.9

Figure 1.2 : Structure de la section transversale de la soie de l'araignée Argiope trifasciata au point de fracture. Tirée de Poza et coll.3

(18)

En diminuant encore l'échelle, nous arrivons aux structures secondaires des protéines. La conformation qu'adopte une protéine est définie par les angles dièdres O (rotation autour du lien N-Ca) et *F (rotation autour du lien Ca-C) tel qu'illustré à la Figure 1.3. Le diagramme de Ramachandran regroupe les différentes structures secondaires suivant leurs angles 0 et *F (Figure 1.4). À cause de l'encombrement stérique causé par la chaîne latérale, seulement certaines paires d'angles dièdres sont permises. Les plus fréquentes sont celles définissant les feuillets P et les hélices a, mais d'autres structures comme les coudes, les tours, les hélices 3io et les hélices 3i de type polyproline II (PPII) sont courantes pour les protéines. Les différentes structures secondaires sont favorisées par plusieurs facteurs comme les interactions ioniques, les liaisons hydrogène, les interactions hydrophobes et les forces de van der Waals.

(19)

Figure 1.4 : Diagramme de Ramachandran. Source Institute for Biocomputation and

Physics of Complex Systems.

10

La structure hélicoïdale la plus commune pour les protéines est l'hélice a qui a un pas droit et comporte 3,6 résidus par tour. Il y a formation d'un lien hydrogène entre les résidus n et

n+4. Dans un brin P, la chaîne est allongée et il y a formation de liaisons hydrogène intermoléculaire avec un autre brin P afin de former un feuillet p. Si les brins P sont dans le même sens, on a un feuillet P parallèle alors que s'ils sont de sens opposés on a un feuillet P antiparallèle. Les peptides polyprolines forment une autre structure secondaire nommée hélice PPII. La structure PPII est une hélice 3i où les résidus adoptent une configuration trans. Cette hélice comporte trois résidus par tour et contrairement à l'hélice a elle a un pas gauche. Les acides aminés ne forment pas de lien hydrogène intra ou inter chaîne, ils en forment plutôt avec l'eau. À la Figure 1.5, on peut voir que la structure PPII est plutôt allongée et bien qu'elle soit hélicoïdale, elle a certaines ressemblances avec un brin p. Par ailleurs, ses angles dièdres <I> et ¥ sont près de ceux des feuillets P (voir Figure 1.4).

(20)

Dans la soie d'araignée, deux structures secondaires sont prédominantes. La spectromicroscopie Raman a permis de montrer que la soie est composée à 36 % de feuillets p. Ils sont très orientés suivant l'axe de la fibre.11 C'est cette structure qui est responsable de la rigidité de la soie. Le 64 % restant est associé aux structures amorphes qui sont faiblement orientées suivant l'axe de la fibre.11 Elles procurent de l'extensibilité à la soie. La spectroscopic infrarouge et la spectroscopic RMN confirment ces résultats.12"14 Les feuillets P sont généralement associés aux cristallites retrouvés dans la soie, toutefois le pourcentage de feuillets p (36 %) est nettement plus élevé que le pourcentage de

• • • S 1 I

cristallinité (12 %). ' Certains articles indiquent la présence de deux populations différentes de feuillets P dans la soie, ce qui permet d'expliquer cette différence.13'15'16

(21)

À la plus petite échelle permettant de caractériser la soie se trouve l'enchaînement des différents acides aminés, ou structure primaire. La soie contient deux protéines nommées MaSpI et MaSpII qui sont présentes respectivement dans un rapport molaire 4 : 1 . Elles ont un poids moléculaire de 350 kDa. Les deux protéines sont constituées de deux motifs qui se répètent sur toute la séquence en plus des segments C- et N-terminal. La partie répétitive de la séquence est présentée à la Figure 1.6. Les protéines MaSpI et MaSpII contiennent des segments contenant environ 6 alanines formant les feuillets p cristallins. Le second segment est riche en glycines. Pour la protéine MaSpII, ce segment est aussi riche en proline, un acide aminé connu pour empêcher la formation de brins P et d'hélices a et de favoriser les hélices PPII.

La RMN des solides a permis de déterminer la structure locale de divers segments de la protéine. Cela permet de mieux comprendre l'utilité des différents segments constituant les structures amorphes. Michal et Jelinski ont montré que les segments Leu-Gly-X-Gln (où X peut être Ser, Gly ou Asn) forment des tours P de type I qui permettent à la chaîne de se replier afin que les segments polyalanine puissent se rencontrer pour former des feuillets P antiparallèles.17 Jenkins et coll. ont déterminé que les segments Gly-Pro-Gly-X-X (où X peut être Gly, Tyr ou Gin) qui sont très présents dans la protéine MaSpII forment des tours P de type II. Ils ont aussi observé que les résidus proline sont affectés par l'hydratation de la soie.18

(22)

Feuillets |3

Structures amorphes

MaSpI (AG(A)

n

GGAGQGGYGGLGSQGAGRGGLGGQG)

)

N=4-7

Feuillets (5

Structures amorphes

I I I

I

MaSpII (S(A)

n

GPGQQGPGGYGPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGX

N=4-10

Figure 1.6 : Structure primaire simplifiée de la soie de l'araignée N. clavipes. Modifiée à partir de Hinman et coll.19

La dynamique de certains acides aminés donne aussi des informations intéressantes sur la

1 1 "\

soie. L'étude du temps de relaxation en RMN H et C de l'alanine indique que cet acide aminé est présent dans deux environnements. Les auteurs associent les résidus alanine avec des temps de relaxation plus longs aux feuillets P cristallins alors que ceux avec des temps de relaxation plus courts seraient dans une structure moins rigide.16 Il a aussi été démontré que les résidus alanine et glycine se retrouvent dans trois environnements distincts. Li et coll. ont montré à partir d'expériences RMN REDOR C-D sur la soie immergée dans le D2O qu'une partie de ces deux acides aminés se deutère rapidement, une autre partie se deutère lentement et finalement le reste n'est pas accessible au D2O. Les auteurs suggèrent que les acides aminés qui se deutèrent lentement se trouvent dans une structure située au pourtour des cristaux de feuillets P, ceux qui se deutèrent rapidement se trouvent dans les structures amorphes et finalement ceux qui ne se deutèrent pas font partie des feuillets P cristallins. 13

(23)

Le ver à soie utilise sa soie pour construire le cocon qui le protégera de l'environnement extérieur et des prédateurs pendant sa métamorphose. Avant d'être prêt pour cette étape importante de son développement, la larve mue cinq fois. Lorsqu'il tisse son cocon, le ver à soie produit deux fibres de fibroïnes et une protéine hydrosoluble nommée séricine. La séricine permet de lier les deux brins de fibroïne avec le reste du cocon de manière à former un matériau composite. Dans le cas du ver à soie, la résistance du fil de soie est beaucoup moins importante que celle du produit fini, le cocon.

1.3.1 Structure microscopique et nanoscopique

L'image obtenue par microscopie électronique à balayage de la soie de B. mori (Figure 1.7) permet d'observer qu'il y a quelques différences avec la soie d'araignée. La soie de B. mori a une forme plutôt ovale qui est irrégulière le long de la fibre. De plus, bien qu'il soit possible d'identifier une zone de transition entre la séricine et la fibroïne, aucune structure de type cœur-coquille n'est identifiable dans la fibroïne.3 Comme pour la soie d'araignée, il

y a des preuves indiquant la présence de microfibrilles faisant 1-2 um de long et 100 nm de diamètre. La diffraction des rayons X a permis de déterminer une cristallinité entre 40 et 55 % pour la fibroïne. Dans ce cas, les cristaux ont une taille d'environ 2 x 4 x 11 nm et sont orientés suivant l'axe de la fibre.

(24)

Figure 1.7 : Structure de la section transversale des deux brins de fibroïne avec la séricine du ver à soie B. mori au point de fracture. Tirée de Poza coll.3

1.3.2 Structures secondaires

La soie de B. mori est constituée d'environ 50 % de feuillets P et 50 % de structures amorphes.11'21 Comme la quantité de feuillets P est plus élevée que dans la soie d'araignée,

cela peut en partie expliquer le caractère plus rigide de la soie du ver à soie (module de Young plus élevé) et, en contrepartie, sa plus faible elongation à la rupture.

1.3.3 Structure primaire et structure secondaire locale

La fibroïne du ver à soie est composée principalement de deux protéines présentes en quantité égale reliées par un pont disulfùre. La première protéine a un poids moléculaire d'environ 350 kDa et appelée la chaîne lourde (heavy chain) et la seconde, la chaîne légère (light chain), a un poids moléculaire de 26 kDa. Une troisième protéine, la P25, se retrouve dans la soie de B. mori, mais sa quantité est négligeable par rapport aux deux autres (six fois moins). Elle a un poids moléculaire de 30 kDa.22 Comme la chaîne légère

est de poids moléculaire beaucoup plus faible que la chaîne lourde et que la P25 est présente en faible quantité, seulement la chaîne lourde sera présentée dans cette section. La séquence répétitive de la protéine chaîne lourde est présentée à la Figure 1.8.

(25)

Feuillets p

Structures amorphes

(GAGAGSGAAS(GAGAGS)

n

GAGAYGAGVGAGYGAGYGAGAGAGY)

x

n = l - l l

Figure 1.8 Structure primaire simplifiée de la protéine chaîne lourde de la fibroïne de B. mori. Modifiée à partir de Mita et coll.23

Comme la soie d'araignée, la soie du ver à soie de B. mori contient deux segments qui se répètent sur toute la séquence de la protéine en plus de contenir des segments N- et C-terminaux. Les feuillets P sont formés par des segments répétitifs GAGAGS. La proportion et la longueur de ces segments ont été corrélées, respectivement, avec la quantité de feuillets p et la taille des cristallites.11' ° La phase amorphe contient aussi des segments alanylglycine et est riche en résidus tyrosine. Il a été montré que la présence de la serine favorise la formation des feuillets P alors que les résidus tyrosine induisent la formation de structures désordonnées dans la fibroïne.

1.4 Protéines recombinantes rMaSpI et rMaSpII

Il est possible de produire les protéines recombinantes analogues à MaSpI (rMaSpI) et à MaSpII (rMaSpII) de la soie d'araignée par génie génétique. Pour ce faire, il s'agit d'introduire le gène qui code pour la structure primaire de la protéine dans l'organisme hôte qui la surexprimera. Plusieurs exemples se retrouvent dans la littérature, notamment l'utilisation de la bactérie E. coli, de plantes et de mammifères.24"28 Un des grands avantages des bactéries est qu'elles peuvent facilement être modifiées génétiquement et cultivées en milieu contrôlé. Une des difficultés pour l'insertion du gène codant les protéines de soie réside dans le fait que les codons de l'ADN de l'araignée ne sont pas nécessairement décryptés de la même manière lorsqu'insérés dans la bactérie. Néanmoins, avec quelques modifications génétiques supplémentaires il a été possible de créer une

77

(26)

L'expression de soie dans les plantes peut être avantageuse puisqu'elles peuvent en produire en grande quantité sans que la protéine nuise à sa croissance. Des rendements de 18 % après purification ont été obtenus pour une protéine analogue à MaSpI exprimée dans

78

les graines d'Arabidopsis.

La production de soie recombinante dans les mammifères est intéressante puisqu'elle permet d'obtenir de bons rendements d'une protéine d'un poids moléculaire relativement élevé. La compagnie Nexia Biotechnologies Inc. a développé une méthode pour en faire la

Oft

production à l'aide de chèvres. Le gène codant pour les protéines rMaSpI et rMaSpII a été inséré dans les cellules mammaires des chèvres par génie génétique. Les protéines sont ensuite purifiées et récupérées sous forme de poudre.

Un des défis à surmonter pour l'utilisation des protéines de soie recombinantes est leur mise en forme pour produire une soie ayant des propriétés mécaniques comparables à celles de la soie naturelle. Afin de contrer ce problème, les groupes de Fraser, Lewis et Jarvis ont modifié génétiquement des vers à soie pour qu'ils produisent de la soie d'araignée au lieu

7Q

de la fibroïne lorsqu'ils tissent leur cocon. Comme le ver à soie est naturellement conçu pour exprimer en grande quantité et entreposer des protéines de haut poids moléculaire en plus d'avoir les glandes nécessaires pour produire le fil, cette voie est très intéressante pour la production en masse de fibres de soie d'araignée recombinante. Leur soie n'est toutefois

7Q

toujours pas aussi résistante que la soie d'araignée naturelle.

Les protéines rMaSpI et rMaSpII utilisées pour les travaux sur l'étude de la structure de la soie en solution ont été obtenues de Nexia Biotechnologies Inc. dans le cadre d'une collaboration. Leurs séquences sont les mêmes que celles de la soie d'araignée naturelle, excepté qu'elles ont un poids moléculaire plus faible (séquence répétitive plus courte) et qu'elle ne possède pas la région N-terminale. Alors que MaSpI et MaSpII ont des poids moléculaires d'environ 350 kDa, rMaSpI et rMaSpII ont des poids moléculaires de 60 et 55 kDa, respectivement.

(27)

1.5 Structure de la soie en solution

Afin de bien comprendre les propriétés de la soie, il est aussi important de connaître sa structure en solution. Bien que cette protéine soit métastable puisqu'elle a tendance à s'agréger en formant des feuillets p, elle est stable à l'intérieur de la glande de l'araignée et du ver à soie. L'obtention d'une solution concentrée de protéine de soie est intéressante pour la réalisation des procédés de filage industriels puisque cela permettrait de se rapprocher des conditions retrouvées naturellement.

La structure de la soie d'araignée et de B. mori en solution est généralement définie comme étant désordonnée. Bien qu'il puisse y avoir un certain ordre local, la chaîne peptidique peut se plier et se déplier rapidement dans les structures désordonnées ce qui fait qu'en moyenne il n'y a pas d'ordre à longue échelle. La RMN des solides de la soie dans la glande a permis de montrer la présence des structures désordonnées dans la soie du ver à soie.30 Cela a aussi été démontré pour la soie d'araignée en utilisant la RMN des solides.31' 32 La spectroscopic RMN de peptides mimant les segments répétitifs de la soie a permis de confirmer cette information. ■ Le dichroïsme circulaire électronique a permis d'identifier la présence de ces structures dans les solutions diluées de soie d'araignée ''35' 6

La structure en hélice 3i de type PPII a été suggérée par Lewis pour les segments polyalanine. Le dichroïsme circulaire vibrationnel des protéines recombinantes rMaSpI et rMaSpII a révélé l'existence de cette structure dans la soie.39 Les hélices 3i PPII pourraient jouer un rôle important dans le processus de filage puisque, bien qu'elles soient stables, il est facile de les convertir en feuillets P antiparallèles, car leurs angles dièdres *P et O sont proches. Les hélices 3i PPII n'ont toutefois pas été identifiées directement pour la soie d'araignée en solution. Leur présence ou absence dans la soie en solution de B. mori revêt aussi un grand intérêt pour une meilleure compréhension du processus de filage.

(28)

1.6 Processus de filage

Alors que la soie est entreposée dans la glande en tant que solution aqueuse très concentrée (entre 30 et 50 %), les fibres de soie sont insolubles dans la plupart des solvants usuels. Au passage dans la glande de l'araignée ou du ver à soie, les protéines de la soie subissent plusieurs stress chimiques et mécaniques qui provoquent la transition de la solution protéique à la fibre. Le processus de filage constitue une étape clé pour la production industrielle de soie à partir de protéines de soie recombinantes.

1.6.1 Glande de l'araignée Nephila clavipes

La glande ampullacée majeure qui produit le fil de trame de la toile de l'araignée se divise en trois parties principales. La première est formée par la queue et l'ampoule. Ensuite vient la seconde partie, le conduit en S qui est divisé en trois sections. Le conduit est rattaché à l'ampoule par l'entonnoir et son diamètre diminue constamment. Au bout du conduit se trouve la valve qui commence la troisième partie de la glande. La valve permet à l'araignée de réguler la quantité de soie filée, sert de frein et peut être utilisée pour pousser un peu de soie afin de redémarrer le filage lorsque le fil se brise.40'41 On trouve finalement un conduit court qui relie la valve à la fusule où la soie sort de l'araignée.42

La Figure 1.9 présente une image de la glande ampullacée majeure de l'araignée N. clavipes dégagée des tissus environnants. Les principales structures de la glande sont identifiées. La soie produite par des cellules spécialisées de la queue est entreposée dans l'ampoule. Dans la section B de l'ampoule sont produites les protéines et glycoprotéines recouvrant la surface de la fibre.42 Lorsque l'araignée a besoin de soie, elle tire sur le bout de fil qui est toujours sorti de la glande, ce qui constitue la force permettant de faire cheminer les protéines tout le long de la glande. Dans l'ampoule, la soie est dans un état liquide cristallin et forme des gouttelettes sphériques ayant un diamètre de quelques microns. " À la sortie de l'ampoule, le diamètre de la glande diminue rapidement dans une région nommée entonnoir. À cet endroit, les gouttelettes de soie ont une forme

(29)

allongée, toutefois aucun changement d'orientation et de conformation n'est observé.4 'M

Ces gouttelettes s'allongent pendant le passage dans le conduit en S. Le rétrécissement graduel du diamètre du conduit permet une elongation à un taux constant ce qui génère un stress dû aux forces de cisaillement faible et constant.43 L'état liquide cristallin semble

important dans le processus de filage puisqu'il permet la cohésion nécessaire pour permettre à la soie de s'écouler en continu. De plus, cela permet à la solution protéique de s'écouler lentement en permettant aux chaînes de s'orienter pendant le filage.42

Figure 1.9 : Image de la glande ampullacée majeure de l'araignée N. clavipes dégagée des tissus environnants. Modifiée à partir de Lefèvre et coll.44

Plusieurs modifications chimiques de la solution se produisent pendant son passage à travers la glande. À partir de la queue jusqu'au bout du conduit en S, la soie liquide s'acidifie. Dans la partie A de l'ampoule, le pH est de 7,3 et diminue à l'approche de l'entonnoir pour s'approcher d'un pH de 6,4. Dans le conduit en S, le pH diminue pour atteindre une valeur de 6,3.45 La rhéologie de la soie indique qu'il se produit une

(30)

modification importante aux forces de cisaillement entre pH 6,4 et pH 6,8.46 De plus, l'acidification de la soie semble favoriser la formation des feuillets p.45 En même temps, le rayon hydrodynamique de la protéine augmente lorsque la soie passe de pH 7,0 à pH 5,0.47 Les ions potassium et sodium semblent aussi impliqués dans le processus de filage. La concentration en Na+ diminue le long du conduit alors que celle du K+ augmente.48 Alors que la concentration en Na+ est 3130 ug/g dans la glande, elle est de 300 ug/g dans la fibre. Dans le cas du potassium, la concentration augmente pendant le filage pour passer de 750 ug/g dans la glande à 2900 pg/g dans la fibre.49 Ces deux ions favorisent la formation de feuillets P, toutefois leurs effets sont différents. L'ion K+ induit la formation de nanofibrilles. De plus, il permet de former davantage de feuillets p que le Na+.49 Dans le dernier repliement, se trouvent les cuticules de la paroi de la glande qui permettent la déshydratation de la soie.41

La formation des feuillets P débute à l'intérieur de la troisième partie du conduit en S.44 La dernière partie du conduit en S contient une région, le goulot, où il y a un rétrécissement rapide du diamètre. À partir du goulot, l'orientation de la solution augmente rapidement pour atteindre son maximum à la valve. En même temps, la quantité de feuillets P augmente jusqu'à la valve. Les feuillets p commencent à être formés avant qu'il puisse être possible d'observer une orientation dans la solution ce qui indique que les deux processus ne sont pas interdépendants. Comme les forces de cisaillement ne sont pas encore très importantes avant le goulot, la force générée par retirement de la soie doit jouer un rôle essentiel dans la formation des feuillets p. Aussi, les différents changements dans la composition chimique de la solution ne sont pas à négliger.

(31)

1.6.2 Glande du ver à soie Bombyx mori

Pour la fibroïne, la force nécessaire pour déplacer la solution protéique dans la glande est produite par le mouvement du ver à soie lorsqu'il tisse son cocon. À ce moment, il bouge sa tête afin de tirer sur son fil en faisant des mouvements en huit et se retourne sur lui-même jusqu'à ce qu'il ait produit suffisamment de fil pour que son cocon soit résistant.1'50 À la Figure 1.10 on peut voir les différentes sections de la glande séricigène du ver à soie B. mori. Les protéines chaîne lourde, chaîne légère et P25 formant la fibroïne sont sécrétées dans la glande postérieure, puis elles sont entreposées dans la glande moyenne sous forme de gel. La séricine est sécrétée de la glande moyenne jusqu'à la partie postérieure. L'expression de la séricine forme un gradient pour atteindre un maximum dans la partie postérieure de la glande.35' 51 Les protéines de séricine produites ont différents poids moléculaires. Puisque la solution concentrée de fibroïne et celle de séricine forment des gels, il n'y a pas de mélange entre elles. Comme pour l'araignée, la soie de B. mori est sous forme liquide cristalline à l'intérieur de la glande. Le processus de filage est assez similaire pour le ver à soie et l'araignée à l'exception que la fibroïne est filée en même temps que la séricine qui la recouvre. De plus, les deux brins de soie sont joints au bout de la section postérieure de la glande dans la presse (non illustré à la Figure 1.10 qui ne montre qu'une des deux glandes) avant d'émerger du ver à soie.51 La presse agit un peu comme la valve de l'araignée en permettant d'exercer la contrainte nécessaire pour retirer l'eau résiduelle et induire l'orientation moléculaire lorsque le ver à soie tire sur son fil.

(32)

AM

Figure 1.10 : Schéma de la glande du ver à soie. Les abréviations sont les suivantes, A : glande antérieure ; AM : section antérieure de la glande du moyenne ; MM : milieu de la glande moyenne ; PM : section postérieure de la glande moyenne ; P : glande postérieure. Tirée de Gamo et coll.52

1.7 Objectifs du projet

Les propriétés mécaniques incomparables de la soie d'araignée en font un sujet d'étude de choix. Comme elles sont intimement reliées à la structure et l'orientation des protéines qui la composent, ces deux points méritent une attention particulière. Un autre point d'intérêt est l'étude de la soie en solution. À l'intérieur de l'araignée, la soie est présente sous forme soluble à une concentration élevée. Une meilleure compréhension de la structure de la soie en solution aiderait pour l'élaboration des divers procédés visant à produire de la soie à partir de protéines de soie recombinantes.

La première partie de ce projet de maîtrise porte sur l'étude de la structure de la soie par spectroscopic infrarouge à réflexion totale atténuée. Des travaux précédents dans le groupe

(33)

du professeur Michel Pézolet avaient permis de démontrer que cette technique permet de déterminer la conformation ainsi que l'orientation des protéines de la soie. La méthodologie a été modifiée afin d'étudier la deuteration de la soie. L'échange deutérium-hydrogène permet de mieux identifier dans le spectre IR-ATR les bandes attribuables à chaque structure secondaire formant les trois phases de la soie (phase amorphe, feuillets p cristallins et interphase). À partir de cette information, il est possible de procéder à une décomposition spectrale des bandes amide, ce qui permet de calculer l'orientation et le pourcentage de structures secondaires.

La seconde partie des travaux de maîtrise porte sur l'étude de la structure de la soie en solution. Les expériences de spectroscopic de dichroïsme circulaire vibrationnel (VCD) et d'activité optique Raman (ROA) ont été réalisées dans le cadre d'un stage à l'Université Bordeaux I à l'Institut des sciences moléculaires sous la supervision du chercheur Thierry Buffeteau. Les spectroscopies VCD et ROA ont l'avantage d'être très sensibles à la chiralité des molécules. Par conséquent, elles sont très utiles pour identifier les différentes structures secondaires qui autrement ne seraient pas différenciables par spectroscopic infrarouge. En spectroscopic IR et VCD il est nécessaire d'utiliser le D2O comme solvant. Le ROA permet de déterminer la structure de la soie dans le H2O qui est le solvant naturel pour la soie.

Les travaux présentés portent sur la soie du ver à soie et sur la soie d'araignée. En étudiant ces deux soies, il est possible de faire des comparaisons qui seront utiles pour faire le lien entre la structure et les propriétés mécaniques des deux fibres. Les travaux sur la soie en solution permettront de vérifier si les deux soies ont des structures secondaires similaires en solution. Dans ce cas, cela confirmerait que cette structure secondaire joue un rôle important dans le processus de filage de la soie.

(34)

2.1 Spectroscopic infrarouge à réflexion totale atténuée

(IR-ATR)

Lorsqu'un faisceau se propageant dans un milieu d'indice de réfraction «j arrive à l'interface avec un milieu d'indice de réfraction plus faible n,, il y a réflexion totale interne si l'angle d'incidence G est supérieur à l'angle critique 6C défini par :45

sin#c=«2/«, Éq. 2.1

En raison de la continuité des champs électriques, une onde évanescente émerge vers le milieu d'indice de réfraction r^. C'est cette onde évanescente qui sera absorbée par l'échantillon, permettant ainsi d'obtenir un spectre IR-ATR. L'amplitude du champ électrique décroit de manière exponentielle dans ce milieu. On définit la profondeur de pénétration dp comme étant la distance parcourue pour que l'amplitude E du champ électrique corresponde à E<je~x (où Eo est l'amplitude initiale du champ électrique et e est le nombre d'Euler). La profondeur de pénétration dépend de la longueur d'onde A, de l'angle d'incidence et des indices de réfraction des deux milieux selon l'équation suivante :45

d = i7 Éq. 2.2 p

2nn\ [sin2 0 - (n2 /«, ) ]/

Bien qu'un cristal d'indice de réfraction faible permette d'avoir une profondeur de pénétration plus grande, et par conséquent une absorption plus grande, il peut être préférable d'utiliser un cristal ayant un indice élevé. En effet, au voisinage d'une bande ayant un coefficient d'extinction élevé comme les bandes amide I et amide II des protéines, il se produit des effets de dispersion anormale. Pour un cristal en diamant ayant un indice de réfraction de 2,4, l'effet est important et produit un déplacement vers les bas nombres

(35)

d'onde du maximum de la bande.53 Comme le coefficient d'extinction ne diminue pas immédiatement après une bande, cela peut aussi déformer les bandes adjacentes. C'est le cas par exemple de la bande amide II des protéines si la bande amide I est intense. Dans le cas de la soie, pour laquelle les protéines sont orientées, cela est d'autant plus problématique que la bande amide I n'a pas la même intensité dans les différentes polarisations, ce qui induit des effets différents sur la bande amide II. Cela rend plus difficile, voire impossible, la décomposition spectrale de la bande amide II dans ce cas. Avec un cristal ATR d'indice de réfraction plus élevé comme le germanium («2= 4), les effets de dispersion anormale sont suffisamment faibles pour ne pas créer de distorsion trop importante.53

2.1.1 Orientation moléculaire et pourcentage de structures

Comme les feuillets P de la soie sont orientés, l'obtention de spectres polarisés linéairement est nécessaire pour bien la caractériser. Généralement, en spectroscopic IR-ATR, on enregistre le spectre de l'échantillon fixe sur le cristal et on change la polarisation du faisceau. Pour pouvoir calculer ensuite l'orientation, il est nécessaire de connaître les champs électriques dans les deux polarisations. Les équations de Harrick permettent de les déterminer lorsqu'on considère un film mince ou épais.45 Toutefois, si le film est semi-épais ou s'il n'y a pas un contact parfait avec le cristal, ces équations ne sont plus valides. Comme la soie est plutôt circulaire, le contact n'est pas parfait et il n'est pas possible de tourner la polarisation afin d'obtenir les informations nécessaires pour la caractériser. Une autre possibilité qui a été proposée par Garside et coll. pour l'étude de la soie, puis développée par Boulet-Audet et coll., est de garder la polarisation fixe et de tourner l'échantillon.21' 54 Dans le cas d'un échantillon ayant une symétrie cylindrique, il est possible de relier au paramètre d'ordre P2 l'absorbance pour un spectre avec l'échantillon parallèle ( A ) ou perpendiculaire ( AL ) au champ électrique.21

(36)

P2=^—!- Éq2.4

2 R + 2

Pour un mode vibrationnel orienté parallèlement à l'axe de référence (axe de la fibre), P2 = 1 ; pour une orientation perpendiculaire, P2 - -0,5 ; et pour un échantillon isotrope P2 = 0. Afin de déterminer la proportion de chaque structure, il faut procéder à la décomposition spectrale du spectre indépendant de l'orientation A\, donné par :

A=^-y^- Eq2.5

2.1.2 Dispositif p o u r la rotation de l'échantillon

Lorsque l'échantillon est tourné, il faut s'assurer d'avoir une bonne précision sur l'angle et d'avoir un contact reproductible avec le cristal ATR. Pour les expériences IR-ATR avec les fibres de soie, un montage conçu précédemment au laboratoire du professeur Michel

71 •

Pézolet a été utilisé. Ce montage avait été utilisé pour faire les spectres ATR d'une seule fibre de soie avec un cristal de diamant. Comme le signal est plus faible avec un cristal de germanium, les spectres sont obtenus à partir de plusieurs fibres. Le montage pour réaliser la rotation de l'échantillon est montré à la Figure 2.1. Les fibres sont placées sur le support à échantillon qui est relié à la roue graduée permettant l'ajustement angulaire. La tige est séparée du support à échantillon par un bloc de mousse qui empêche d'exercer une pression excessive sur la fibre. La butée permet de toujours descendre l'échantillon de la même manière, assurant ainsi un contact reproductible avec le cristal. Le dispositif permet l'ajustement latéral de l'échantillon afin de s'assurer que les fibres sont bien centrées sur le cristal ATR. Le faisceau infrarouge est toujours polarisé en S.

(37)

Figure 2.1 : Dispositif permettant la rotation de l'échantillon montrant la roue graduée (A),

71

le support (B), la tige (Z) et la butée (F). Modifiée à partir de Boulet-Audet et coll.

2.2 Activité optique vibrationnelle

L'interaction de la lumière polarisée avec la matière se manifeste de plusieurs manières. Dans la section précédente, la technique utilisée (IR-ATR) se basait sur l'absorption préférentielle de la lumière infrarouge polarisée linéairement par un groupement chimique orienté préférentiellement dans une direction. L'activité optique, quant à elle, se caractérise par une interaction différente des molécules chirales avec la lumière polarisée circulairement à gauche (PCG) ou la lumière polarisée circulairement à droite (PCD). À des longueurs d'onde où l'échantillon n'est pas absorbant, on observe une différence entre les indices de réfraction pour la lumière PCG et PCD dans les systèmes chiraux. Ce phénomène constitue la base de la première technique basée sur l'activité optique, le pouvoir rotatoire. Puisque la vitesse de propagation de la lumière et son absorption sont

(38)

reliées, pour un milieu ayant un pouvoir rotatoire il y aura une absorption différente pour lumière PCG et PCD. Ce phénomène constitue la base du dichroïsme circulaire.

Les premières mesures de dichroïsme circulaire ont été faites pour les transitions électroniques dans l'ultraviolet et le visible (dichroïsme circulaire électronique ou ECD). En 1974, le groupe de George Holwartz a démontré expérimentalement la possibilité de mesurer un dichroïsme circulaire pour les transitions vibrationnelles dans le domaine infrarouge (dichroïsme circulaire vibrationnel ou VCD). Cela avait été prédit théoriquement en 1972 par le même groupe.55 Une autre forme d'activité optique vibrationnelle basée est l'activité optique Raman ou ROA a été prédite en 1971 par le groupe de Laurence Barron. Les premières mesures expérimentales ont été réalisées en 1973 par ce même groupe.55

Comme la majorité des groupements chimiques génèrent une ou plusieurs transitions vibrationnelles, le VCD et le ROA permettent de déterminer la configuration absolue de plusieurs molécules possédant un ou plusieurs centres stéréogéniques. En fait, ces deux techniques sont les seules permettant de déterminer la configuration absolue de liquides sans dérivatisation.56

2.2.1 Dichroïsme circulaire vibrationnel

2.2.1.1 Spectroscopie de dichroïsme circulaire vibrationnel

Le dichroïsme circulaire vibrationnel se base sur la différence d'absorption dans le domaine de l'infrarouge entre la lumière polarisée circulairement vers la gauche et vers la droite des molécules chirales. En spectroscopie infrarouge, les spectres sont généralement présentés avec une échelle d'absorbance où

(39)

Io est l'intensité du signal en absence d'échantillon (référence) et I est l'intensité après le

passage du faisceau dans l'échantillon. En VCD, on utilise plutôt la différence

d'absorbance A4 entre la lumière PCG ( Aj ) et PCD ( A

D

).

^ = A}~

A

D

Éq. 2.7

VT

Vo

Figure 2.2 : Transitions vibrationnelles avec la lumière polarisée circulairement vers la gauche et vers la droite. Modifiée à partir de Nafie.57

La Figure 2.2 montre le diagramme de niveaux d'énergie pour la transition du niveau fondamental v0 vers le premier niveau vibrationnel v,. En spectroscopie infrarouge,

l'activité d'un mode de vibration dépend du carré du moment dipolaire électrique. En VCD, l'activité dépend de la partie imaginaire du produit scalaire entre les vecteurs du moment de transition dipolaire électrique et du moment de transition dipolaire magnétique. Par conséquent, pour qu'une vibration ait une activité optique, les moments dipolaires électrique et magnétique doivent être différents de zéro et ne doivent pas être orthogonaux. L'activité optique d'une molécule chirale décroit lorsqu'on utilise de grandes longueurs d'onde.59 Cette technique a par conséquent une sensibilité plus faible que le dichroïsme

circulaire électronique, mais un nombre plus élevé de transitions sont observables dans l'infrarouge. Typiquement, les valeurs de AA sont entre quatre et cinq ordres de grandeur plus faibles que l'absorbance en spectroscopie infrarouge.

(40)

2.2.1.2 Spectromètre de dichroïsme circulaire vibrationnel

La Figure 2.3 montre le schéma d'un appareil VCD. La source ainsi que l'interféromètre de Michelson sont les mêmes que l'on retrouve dans les spectromètres infrarouge à transformée de Fourier. L'interféromètre permet d'encoder le signal pour chaque longueur d'onde en générant une modulation sinusoïdale de l'intensité à la fréquence de Fourier coF

qui est typiquement autour de 16 kHz.60 Le faisceau est épuré à l'aide d'un filtre optique, puis est polarisé linéairement à 45° de l'axe du modulateur photoélastique (PEM). Le PEM permet de convertir à une fréquence élevée a>M de 50 à 74 kHz la lumière incidente polarisée linéairement soit en lumière PCG, soit en lumière PCD. Le faisceau traverse ensuite l'échantillon, puis est détecté.57

Filtre optique Échantillon Source Interféromètre — u Polariseur Modulateur de polarisation photoélastique

Figure 2.3 : Schéma du spectromètre VCD.

Au détecteur, on retrouve deux interférogrammes. Le premier est modulé à la fréquence de Fourier. Le second est modulé à la fréquence de Fourier et à la fréquence de modulation de la polarisation. Pour retrouver le spectre VCD, il faut d'abord démoduler le signal du PEM à l'aide de détection synchrone référencée à la fréquence du PEM. Une transformée de Fourier est alors appliquée aux deux interférogrammes. Le rapport des deux signaux donne le spectre VCD.57

(41)

2.2.1.3 Spectres de dichroïsme circulaire vibrationnel théoriques pour les différentes structures secondaires dans le IM)

Puisque les spectres d'activité optique vibrationnelle sont des spectres de différence, on retrouve des bandes positives et négatives. Afin de bien déterminer la structure secondaire d'une protéine, il est possible d'utiliser la position et l'intensité relative des bandes de la région amide I qui est sensible à la conformation. La Figure 2.4 montre les spectres VCD simulés pour les différentes structures secondaires des protéines dans le D2O.

o Q i x i < r 5 X 10 <

1

o -5x10 c -1 x 10" -2 x 10 ' Hélices a ' Structures désordonnées 1 Feuillets P

■ Hélices 3 gauche (type PPII)

1 1 1 1

1750 1 700 1650 1600

Nombre d'onde cm'1

1550

Figure 2.4 : Spectres VCD obtenus par simulation spectrale des principales structures secondaires des protéines dans le D2O. Thierry Buffeteau, Université Bordeaux I, 2006, résultats non publiés.

Pour une hélice a qui est une hélice de pas droit, il y a d'abord une bande négative à 1660 cm'1 et une bande positive d'intensité similaire à 1650 cm"1. Ce spectre correspond bien au spectre de la poly-L-lysine en hélice a et à celui de protéines avec un contenu élevé en hélice a.61'62 Pour les feuillets P antiparallèles, on retrouve deux bandes négatives à 1675 et

(42)

1635 cm" , des positions similaires à celles observées sur le spectre infrarouge conventionnel.63 Pour une hélice gauche 3i (de type polyproline II ou PPII), on retrouve une bande d'intensité moyenne positive à 1665 cm"1 et une bande plus intense négative à 1639 cm"1. La position de la bande pour une structure PPII peut être affectée par plusieurs facteurs. La bande négative des hélices PPII comportant beaucoup de prolines est à un nombre d'onde plus bas que celles en contenant peu ou pas.64 Les structures désordonnées ne donnent pas de spectre en VCD.63 En effet, comme le VCD est très sensible à l'ordre à grande échelle, la différence d'absorption dans la région amide I provient plus de la chiralité de l'ensemble de la structure secondaire que de chaque acide aminé individuel. Pour cette raison, les structures désordonnées ont un signal apparaissant comme nul puisque pour ces structures il n'y a pas d'ordre défini entre les acides aminés.

2.2.2 Activité optique R a m a n (ROA)

2.2.2.1 Spectroscopie d'activité optique Raman

L'effet Raman est un processus de diffusion inélastique de la lumière. Puisque c'est un processus à deux photons, il y a quatre stratégies expérimentales possibles pour l'observation de l'activité optique Raman en travaillant avec un faisceau incident polarisé linéairement ou circulairement et en récoltant la lumière polarisée linéairement ou circulairement. La première configuration qui a été utilisée pour l'observation du ROA est celle où le faisceau incident est polarisé circulairement et où l'intensité de la lumière diffusée est polarisée linéairement (ICP-ROA).46

(43)

M

Niveau virtuel

n

0 Vi Vo

" D " G

l r " D

A l = l

D

- I

Figure 2.5 : Transition vibrationnelle en activité optique Raman avec la configuration SCP (scattered circular polarisation - diffusion polarisée circulairement). Excitation avec la lumière polarisée linéairement et détection de la lumière diffusée polarisée circulairement.

C'y

Modifiée à partir de Nafie.

Le premier appareil commercial ROA utilise plutôt la configuration SCP-ROA (scattered circular polarisation - Raman optical activity, où activité optique Raman - diffusion polarisée circulairement). La Figure 2.5 montre le diagramme de niveaux d'énergie pour la transition Stokes ROA. Dans cette configuration, le laser incident a une polarisation linéaire ou est complètement dépolarisé. Après diffusion Raman dans un échantillon chiral, on mesure l'intensité de la lumière polarisée circulairement vers la droite et vers la gauche pour chaque longueur d'onde. À partir de ces deux valeurs d'intensité, on peut calculer les spectres Raman et ROA.

I" = I" + r AI" =1" -I"

LU 1D 1G

Eq. 2.9 Éq.2.10

(44)

Les exposants a réfèrent à la polarisation du laser (soit dépolarisé, soit linéaire). Les indices font référence aux polarisations circulaires vers la droite ou vers la gauche de la lumière diffusée. L'addition des deux composantes (Éq. 2.9) donne le spectre Raman de l'échantillon alors que la soustraction (Éq. 2.10) donne le spectre SCP-ROA. Il est important de noter que la convention en ROA est de soustraire la composante PCG à celle PCD, contrairement au VCD (voir Éq. 2.7).

Lorsque la longueur d'onde du laser incident est loin de toute bande d'absorption électronique, l'activité optique Raman dépend de trois facteurs : le tenseur de polarisabilité Raman, le tenseur du dipôle magnétique Raman et le tenseur d'activité optique du quadripole électrique.60 Pour les protéines, l'activité optique Raman est entre quatre et cinq ordres de grandeur plus faible que l'effet Raman.

2.2.2.2 Spectromètre d'activité optique Raman en configuration SCP

La Figure 2.6 montre le schéma du spectromètre ROA développé par la compagnie BioTools, Inc. et commercialisé sous le nom de ChiralRaman™.65 Il repose sur la conception proposée par W. Hug et G. Hangartner.66 Le laser utilisé est un laser vert à 532 nm. Il est possible d'utiliser un laser émettant à une autre longueur d'onde en utilisant des pièces optiques adaptées. Le laser passe à travers un polariseur afin de sélectionner une seule polarisation linéaire. Le laser passe ensuite à travers deux lames demi-onde configurées de manière à éliminer tout état net de polarisation linéaire et circulaire dans le temps, ce qui permet d'obtenir de la lumière complètement dépolarisée.

(45)

Optique pour conditionner Polariseur le faisceau Laser

f-

Prisme Échantillon Retardateur de phase à cristaux liquides p Cubes séparateurs de polarisation Fibre optique

X

Filtre Notch Fibre P optique

V

/ Détecteur CCD Spectrographe

Figure 2.6 : Schéma du spectromètre SCP-ROA. Modifiée à partir de Nafie. 67

Le faisceau passe ensuite à travers un prisme pour se rendre à l'échantillon. La lumière rétrodiffusée (diffusions Rayleigh, Stokes et anti-Stokes) est réfléchie et la raie du laser est filtrée par un filtre Notch. La lumière PCG et PCD est ensuite convertie en lumière polarisée linéairement de manière orthogonale par un retardateur à cristaux liquides agissant comme une lame quart d'onde modulable. Une fois sur deux, la lumière PCD sera convertie en lumière polarisée P et l'autre fois elle sera convertie en lumière polarisée S et la lumière PCG prendra l'autre polarisation. Cela permet de bien compenser toute imperfection qu'il pourrait y avoir dans le reste du parcours optique et au détecteur. Les deux polarisations linéaires orthogonales sont séparées par un cube séparateur de polarisation. La lumière polarisée P passe au travers du cube alors que la lumière polarisée S est réfléchie. Puisque la lumière réfléchie a une petite contamination de lumière polarisée

(46)

P, un second cube séparateur de polarisation est utilisé pour purifier la polarisation. Chacun des deux faisceaux est focalisé à l'aide de lentilles sur un faisceau de 31 fibres optiques. Chaque branche est détectée sur une moitié du détecteur CCD multicanaux après que les différentes longueurs d'onde aient été séparées par un réseau de diffraction holographique.

2.2.2.3 Spectre d'activité optique Raman typiques pour les différentes structures secondaires

La Figure 2.7 présente les spectres Raman et ROA caractéristiques pour les protéines en hélices a, en feuillets P et en hélices PPII dans l'eau. La Figure 2.8 présente les spectres Raman et ROA du peptide Acétyl-OOAAAAAAAOO-Amide (où O = ornithine) et le poly-1-glutamate qui adoptent une structure PPII en solution dans l'eau. En ROA, la bande la plus sensible à la structure secondaire est la bande amide III qui provient en majeure partie de l'élongation CN du lien peptidique et de la déformation des NH dans le plan. Les hélices a se caractérisent par une bande intense positive à -1345 cm"1 alors que les feuillets P présentent une bande de moyenne intensité négative à 1247 cm" . " . Dans la bande amide I ces deux structures présentent un doublet négatif-positif. Pour les hélices a, il y a une bande négative de faible intensité à 1638 cm'1 alors que pour les feuillets P elle se trouve à 1648 cm" . La bande des structures de type PPII peut varier légèrement selon la protéine ou le peptide étudié, toutefois la forme de la bande reste toujours la même. Il y a une bande négative de faible intensité entre 1257 et 1265 cm"1 et une bande positive intense entre 1312 et 1318 cm"1.71

(47)

400 600 800 1000 1200 Nombre d'onde/ cm"1

1400 1600

Figure 2.7 : Spectres Raman (ID + IG) et ROA (ID - IG) de (A) albumine de sérum humain (hélices a), (B) immunoglobuline humaine (feuillets P), (C) P-caséine bovine (PPII). Modifiée à partir de Zhu et coll.69

(48)

o o o u Acetyl-OOAAAAAAAOO-Amide

yvV-*

]4 5x10s poly(l-glutamate) 1319 1677 **l\juJ\,, 1090 l 5 7x10! 800 1000 1200 400 Nombre d'onde / cm' 1600

Figure 2.8 : Spectres Raman (ID + IG) et ROA (ID - IG) du peptide

Acetyl-OOAAAAAAAOO-Amide (O = ornithine) à pH 4,6 et du poly-L-glutamate à pH 12,6 adoptant la structure PPII dans l'eau. Modifiée à partir de McColl et coll.71

(49)

3.1 Préparation des échantillons de soie d'araignée

Puisque la soie d'araignée ne peut pas être récoltée en quantité suffisante à partir de la toile, il est nécessaire de faire du filage forcé. L'araignée est d'abord anesthésiée avec du CO2 gazeux, puis immobilisée sur un bloc de styromousse. Afin de s'assurer que la soie soit représentative de la soie naturelle, il est nécessaire d'attendre que l'araignée soit complètement réveillée avant de commencer le filage.72 La soie est enroulée autour d'une

éprouvette (ou du support à échantillon dans le cas des expériences de deuteration) à une vitesse de 1 cm/s. L'araignée est surveillée à l'aide d'un binoculaire pour s'assurer de récolter uniquement la soie ampullacée majeure. Pour les expériences sur la deuteration de la soie, l'araignée est filée pendant environ 20 minutes. Pour les expériences sur la soie solubilisée, le filage dure généralement entre deux et trois heures, ce qui permet de récolter de deux à quatre milligrammes de soie. Les fibres sont collées de chaque côté du support à échantillon avec une goutte de colle cyanoacrylate.

3.2 Préparation des échantillons de soie de B. mori

Afin d'isoler la fibroïne, il faut procéder au décreusage de la soie qui consiste à retirer la séricine. Pour ce faire, les cocons sont chauffés dans une solution aqueuse de NaHC03 0,05% pendant 45 minutes. Lorsque la séricine est retirée, les cocons sont rincés trois fois avec de l'eau distillée à 90 °C afin de s'assurer qu'ils ne soient pas contaminés par le sel et la séricine. Les cocons sont finalement séchés à l'air.

Pour les expériences sur la deuteration de la soie, des fibres de soie d'environ 10 cm sont retirées du cocon une par une à l'aide d'une pince fine. Elles sont placées une par une sur le support à échantillon pour l'ATR. Un cure-dent est placé de chaque côté de la fibre afin d'avoir une petite tension dans la fibre, ce qui permet de s'assurer que toutes les fibres

Figure

Figure 1.1 : Courbe contrainte-élongation de la soie de la glande ampullacée majeure de  l'araignée Nephila edulis et de la fibroïne du ver à soie Bombyx mori
Figure 1.2 : Structure de la section transversale de la soie de l'araignée Argiope trifasciata  au point de fracture
Figure 1.3 : Lien amide entre deux acides aminés avec les angles dièdres O et ¥
Figure 1.4 : Diagramme de Ramachandran. Source Institute for Biocomputation and  Physics of Complex Systems
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