1. Utilisation d’oligonucléotides antisens
Les expériences menées in vitro avec le Tc CTG ont montré des résultats intéressants, avec une diminution de la quantité de muHTT, sans impacter le niveau de transcrits HTT. Cet oligonucléotide a donc été injecté par voie ICV dans des souris YAC128 (Fiche technique n°7) qui, en plus des deux allèles Hdh murins sauvages, contiennent le gène HTT humain entier avec 128 répétitions CAG. Les souris ont reçu soit une seule injection de 50 ou 100 µg de Tc CTG, soit 3 doses de 50µg (50µg/sem sur trois semaines) grâce à un système de canule permettant de réaliser des injections répétées. Dans un premier temps, les souris ont été sacrifiées deux semaines après la fin du traitement afin de prélever différentes régions du cerveau. Le cortex, l’hippocampe, le striatum ainsi que le cervelet ont ensuite été isolés pour analyser l’efficacité des traitements dans les différentes régions du cerveau. Compte tenu des résultats observés in vitro, nous avons tenu à regarder le niveau d’ARNm HTT par RT-PCR en amplifiant les répétitions CAG, qui est la zone de fixation des Tc CTG (Figure 40).
Figure 40 : Gels d’agarose de RT-PCR permettant d’amplifier l’exon 1 avec les répétitions CAG.
L’effet de Tc CTG sur le niveau d’expression de HTT est ainsi évalué dans le cortex, l’hippocampe, le striatum et le cervelet après injections de différentes doses de Tc CTG dans le ventricule latéral droit de souris YAC128. n=3 souris injectées avec du PBS, 2 injectées avec 50µg de Tc CTG et 2 injectées avec 3x50µg de Tc CTG.
- Résultats - Evaluation in vivo - Approche de silencing allèle spécifique -
Les gels montrent une diminution du niveau d’ARNm HTT dans l’ensemble du cerveau (cortex, hippocampe, striatum et cervelet) dans les souris ayant reçu 3 fois 50 µg de Tc CTG. Afin de savoir si ce résultat est un biais dû à la fixation de l’ASO sur la région à amplifier ou si le Tc CTG influe réellement sur le niveau d’ARNm HTT, des PCR quantitatives ont été réalisées au niveau des exons 7 et 8 (Figure 41A) et 64 et 65 (Figure 41B). Les TcCTG n’entraînent donc pas de diminution du transcrit HTT, ce qui est cohérent avec ce que l’on avait observé in vitro.
Figure 41 : Effet des ASO synthétiques sur le niveau total d’ARNm HTT dans le cortex, hippocampe, striatum et cervelet après injection de différentes doses de Tc CTG dans le ventricule latéral droit de souris YAC128.
A. Résultats de la PCR quantitative réalisée entre les exons 7 et 8. B. Résultats de la PCR quantitative réalisée entre les exons 64 et 65. Résultats exprimés en moyenne ± SEM. n=3 souris injectées avec du PBS, 4 injectées avec 50µg de Tc CTG, 1 injectée avec 100 µg et 2 injectées avec 3x50µg de Tc CTG.
Afin de voir si le Tc CTG est capable de bloquer la traduction in vivo, nous avons évalué le niveau de HTT par western blot. L’anticorps MAB2166 permet de révéler le doublet protéique : la bande supérieure correspond à muHTT humaine et la bande inférieure à HTT sauvage murine (Figure 42A). Le dernier puits correspond à un échantillon de souris sauvage, et confirme bien la présence de la protéine murine uniquement. Globalement, il n’y a pas de diminution significative de HTT après injections des différentes doses de Tc CTG.
Figure 42 : Evaluation du niveau de HTT dans le cortex, l’hippocampe, le striatum et le cervelet après injection de différentes doses de Tc CTG dans le ventricule latéral droit de souris YAC128.
A. Western blot avec anticorps MAB2166 qui reconnaît muHTT humaine et HTT murine. B. Quantification de muHTT normalisée par rapport à la vinculine. C. Quantification de HTT sauvage normalisée par rapport à la vinculine. Résultats exprimés en moyenne ± SEM. n=3 souris injectées avec du PBS, 4 injectées avec 50µg de Tc CTG, 1 injectée avec 100 µg et 2 injectées 3x50µg de Tc CTG. Les astérisques montrent une différence significative entre la condition traitée et la condition contrôle : *p<0,05, **p<0,01 et ***p<0,001, Test ANOVA à 2 facteurs, Bonferroni. WT : Souris sauvage (pour Wild-Type).
2. Utilisation d’une approche vectorisée
Suite aux résultats encourageants obtenus in vitro avec les lentivirus U7-CTG12, CTG19 et CTG7DS, ces constructions U7 ont été vectorisées dans un vecteur AAV2/9 afin de permettre un transfert de gène efficace dans le cerveau. Basé sur les résultats de notre étude in vitro, nous avons dans un premier temps évalué l’efficacité du U7-CTG12. Les souris ont été
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injectées en ICV avec 3µl de AAV-U7-CTG12 à 1,8x1012 vg/ml, soit 5,4x109 vg, et ont été analysées 2, 4 ou 8 semaines après injection. La PCR quantitative présentée figure 43 montre une absence de diminution d’ARNm HTT dans les différentes parties du cerveau quelle que soit la durée post-injection.
Figure 43 : Effet des AAV-U7snRNA ciblant les répétitions CAG après injection ICV chez la souris YAC128 sur le niveau d’ARNm HTT.
A. Résultats de la PCR quantitative réalisée entre les exons 7 et 8. B. Résultats de la PCR quantitative réalisée entre les exons 64 et 65.
Comme précédemment, les niveaux de HTT ont été évalués afin de savoir si l’AAV-U7-CTG12 est capable de bloquer la traduction de la huntingtine. Comme on le voit sur la figure 44A, les valeurs obtenues pour les souris injectées avec du PBS sont extrêmement variables, ce qui empêche de pouvoir conclure sur l’efficacité de la molécule. En effet, comme on le voit sur les graphiques, la diminution de muHTT est très forte dans l’hippocampe et dans le striatum deux semaines après injection (flèches rouges), mais cela n’est pas significatif puisque les niveaux de certaines souris injectées avec du PBS sont également très bas. Il est donc nécessaire de répéter ces injections afin d’obtenir un nombre de souris plus important et de pouvoir conclure quant à l’efficacité de ces AAV-U7-CTG.
Figure 44 : Effet des AAV-U7 ciblant les répétitions CAG sur le niveau de HTT après injection ICV de souris YAC128.
A. Western blot avec anticorps MAB2166 qui reconnaît muHTT et HTT murine dans les différentes structures cérébrales étudiées. B. Quantification de muHTT normalisée par rapport à la vinculine. C. Quantification de HTT sauvage normalisée par rapport à la vinculine. Résultats exprimés en moyenne ± SEM. n=4 souris injectées avec du PBS, 6 souris injectées avec 5,4x109 vg d’AAV-U7-CTG12, dont 2 ont été sacrifiées 2, 4 et 8 semaines après injection. Les astérisques montrent une différence significative entre la condition traitée et la condition contrôle : *p<0,05, **p<0,01 et ***p<0,001, Test ANOVA à 2 facteurs, Bonferroni.
Ces résultats sont toutefois encourageants et le U7-CTG12 mérite d’être étudié de façon plus approfondie. Dans le temps limité qu’il me restait pour mon projet, la priorité a été donné à l’évaluation in vivo de l’approche allèle non spécifique qui semblait la plus prometteuse.
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