II : mode opératoire
SEEPP-(Φ) 12 -RKLMEII-NH 2 SEEPP-(Φ) 13 -RKLMEII-NH 2
n AA Dérivé Temps Eq quantité n AA Dérivé Temps Eq quantité
Sur 0.30 mmol de résine Boc-(Φ)11-RKLMEII-NH2 Sur 0.15 mmol de résine Boc-(Φ)12-RKLMEII-NH2
19 Ortho Boc-ortho-OH 5 H 3 238 mg 20 Ortho Boc-ortho-OH 5 H 3 119 mg La moitié de la résine est conservée (0.15 mmol)
20 Pro Boc-Pro-OH 2 H 4 129 mg 21 Pro Boc-Pro-OH 1+1 H 4 129 mg
21 Pro Boc-Pro-OH 2+1 H 4 129 mg 22 Pro Boc-Pro-OH 1+1 H 4 129 mg
22 Glu Boc-Glu(Ochx)-OH 1+1 H 4 197 mg 23 Glu Boc-Glu(Ochx)-OH 1+1 H 4 197 mg 23 Glu Boc-Glu(Ochx)-OH 1 H 4 197 mg 24 Glu Boc-Glu(Ochx)-OH 1 H 4 197 mg
24 Ser Boc-Ser(Bzl)-OH 1 H 4 177 mg 25 Ser Boc-Ser(Bzl)-OH 1 H 4 177 mg
Tableau 23 : tableau de synthèse de SEEPP-(Φ)12-RKLMEII-NH2 et SEEPP-(Φ)13-RKLMEII-NH2
Les conditions de décrochage du peptide et de traitement sont les mêmes que celles utilisées précédemment.
II 3 3 : Incorporation de (C5)x et de (Ortho)x (Modèle 2)
Synthèse de SEEPPISLDLTFHLLREVL-(C5)10-RKLMEII-NH2 (37) 133 mg de résine MBHA substituée à 0.9 mmol/g (0,15 mmol) est utilisé, l’agent de couplage est le BOP et nous avons utilisé 4 eq d’amino acide et 3 eq de Boc-C5-OH. Après chaque couplage d’un résidu Boc-C5-OH un capping par Ac2O est effectué. Les conditions de couplage sont résumées dans le Tableau 24.
n AA Dérivé Temps quantité n AA Dérivé Temps quantité
1 Ile Boc-Ile-OH 3+3 H 150 mg 24 His Boc-His(Tos)-OH 4+12 H 245 mg
2 Ile Boc-Ile-OH 1.5 H 150 mg 25 Phe Boc-Phe-OH 12 H 159 mg
3 Glu Boc-Glu(Ochx)OH 1.5 H 197 mg 27 Thr Boc-Thr(Bzl)-OH 12 H 186 mg
4 Met Boc-Met-OH 1.5 H 161 mg 27 Leu Boc-Leu-OH 4 H 150 mg
5 Leu Boc-Leu-OH 12 H 150 mg 28 Asp Boc-Asp(Ochx)-OH 12 H 189 mg
6 Lys Boc-Lys(2ClZ)-OH 1.5 H 248 mg 29 Leu Boc-Leu-OH 4 H 150 mg
7 Arg Boc-Arg(Tos)-OH 12 H 288 mg 30 Ser Boc-Ser(Bzl)-OH 12 H 177 mg
8 à 17 C5 Boc-C5-OH 5 H 101 mg 31 Ile Boc-Ile-OH 4 H 150 mg
18 Leu Boc-Leu-OH 5 H 150 mg 32 Pro Boc-Pro-OH 12 H 129 mg
19 Val Boc-Val-OH 12 H 130 mg 33 Pro Boc-Pro-OH 4 H 129 mg
20 Glu Boc-Glu(Ochx)-OH 3 H 197 mg 34 Glu Boc-Glu(Ochx)-OH 12 H 197 mg 21 Arg Boc-Arg(Tos)-OH 2x12 H 288 mg 35 Glu Boc-Glu(Ochx)-OH 12 H 197 mg
22 Leu Boc-Leu-OH 4 H 150 mg 36 Ser Boc-Ser(Bzl)-OH 12 H 177 mg
23 Leu Boc-Leu-OH 4 H 150 mg
Tableau 24 : Nature et quantité des résidus utilisés. AA : Acide Aminé
Le peptide est décroché de son support par un traitement au HF en présence d’anisole. On obtient 288 mg de produit brut (rdt : 44 %) dont les pics caractéristiques en masse sont : (M+3H+)/3 :1451.9 ; (M+4H+)/4 :1089.1 ; (M+5H+)/5 :871.6; → M : 4352 g.mol-1. Après purification, nous avons obtenus 14,2 mg (2,2 %).
Synthèse de SEEPPISLDLTFHLLREVL-(Φ)5-RKLMEII-NH2 (38) 133 mg de résine MBHA substituée à 0.9 mmol/g (0,15 mmol) est utilisé l’agent de couplage est le BOP et nous avons utilisé 4 eq d’amino acide et 3 eq de Boc-ortho-OH. Après chaque couplage d’un résidu Boc-ortho-OH un capping par Ac2O est effectué. Les conditions de couplage sont résumés dans le Tableau 25.
n AA Dérivé Temps quantité n AA Dérivé Temps quantité
1 Ile Boc-Ile-OH 3+3 H 150 mg 19 His Boc-His(Tos)-OH 4+12 H 245 mg
2 Ile Boc-Ile-OH 1.5 H 150 mg 20 Phe Boc-Phe-OH 12 H 159 mg
3 Glu Boc-Glu(Ochx)OH 1.5 H 197 mg 21 Thr Boc-Thr(Bzl)-OH 12 H 186 mg
4 Met Boc-Met-OH 1.5 H 161 mg 22 Leu Boc-Leu-OH 4 H 150 mg
5 Leu Boc-Leu-OH 12 H 150 mg 23 Asp Boc-Asp(Ochx)-OH 12 H 189 mg
6 Lys Boc-Lys(2ClZ)-OH 1.5 H 248 mg 24 Leu Boc-Leu-OH 4 H 150 mg
7 Arg Boc-Arg(Tos)-OH 12 H 288 mg 25 Ser Boc-Ser(Bzl)-OH 12 H 177 mg
8 à 12 Ortho Boc-ortho-OH 5 H 120 mg 27 Ile Boc-Ile-OH 4 H 150 mg
13 Leu Boc-Leu-OH 5 H 150 mg 27 Pro Boc-Pro-OH 12 H 129 mg
14 Val Boc-Val-OH 12 H 130 mg 28 Pro Boc-Pro-OH 4 H 129 mg
15 Glu Boc-Glu(Ochx)-OH 3 H 197 mg 29 Glu Boc-Glu(Ochx)-OH 12 H 197 mg 16 Arg Boc-Arg(Tos)-OH 2x12 H 288 mg 30 Glu Boc-Glu(Ochx)-OH 12 H 197 mg
17 Leu Boc-Leu-OH 4 H 150 mg 31 Ser Boc-Ser(Bzl)-OH 12 H 177 mg
18 Leu Boc-Leu-OH 4 H 150 mg
Tableau 25 : Nature et quantité des résidus utilisés. AA : Acide Aminé
Le peptide est décroché de son support par un traitement au HF en présence d’anisole. On obtient 290 mg de produit brut (rdt : 51 %) dont les pics caractéristiques en masse sont : (M+3H+)/3 :1276,6 ; (M+4H+)/4 :957,8 ; (M+5H+)/5 :766,4; → M : 3822 g.mol
-1
. Après purification, nous avons obtenus 11,5 mg (2 %).
II 4 : Les hybrides pseudo-peptidiques du 9-41 hCRF
II 4 1 : Incorporation de (C5)x
Nous sommes partis de 120 mg de résine Rink amide substituée à 0,7 mmol/g (0,084 mmol) pour chaque composé, l’agent de couplage est l’HBTU, 4 équivalents d’une solution 0,5M d’amino acide et de Fmoc-(C5)-OH dans la NMP sont utilisés et un double couplage pour chaque étape. Le temps d’un couplage est de 90 minutes et celui de déprotection de 20 minutes. Pour décrocher le peptide de son support, on utilise le même protocole que pour le hCRF.
II 4 2 : Incorporation de (Ortho)x
Synthèse de H-(Φ)9-RKLMEII-NH2 (44), H-(Φ)10-RKLMEII-NH2 (45) et H-(Φ)11-RKLMEII-NH2 (46)
Nous sommes partis d’un lot de 500 mg de résine PAL-PEG-PS fonctionnalisée à 0.360 mmol/g (0.180 mmol). L’agent de couplage est l’HBTU pour toute la synthèse et après l’encrage du dixième ortho la résine a été partagée en deux lots. Les conditions de couplage sont résumées dans le Tableau 26
n AA Dérivé Temps de couplage Eq quantité
1 Ile Fmoc-Ile-OH 2 x 1 Heure 4 254 mg
2 Ile Fmoc-Ile-OH 2 x 1 Heure 4 254 mg
3 Glu Fmoc-Glu(OtBu)-OH 2 x 1 Heure 4 306 mg
4 Met Fmoc-Met-OH 2 x 1 Heure 4 267 mg
5 Leu Fmoc-Leu-OH 2 x 1 Heure 4 254 mg
6 Lys Fmoc-Lys(Boc)-OH 2 x 1 Heure 4 337 mg
7 Arg Fmoc-Arg(Pmc)-OH 2 x 1 Heure 4 477 mg
8 à 17 ortho Fmoc-ortho-OH 3 Heures 3 209 mg
La moitié de la résine est prélevée soit 0.090 mmol et clivée pour donner H-(Φ)10-RKLMEII-NH2
18 ortho Fmoc-ortho-OH 2 x 3 Heures 3 105 mg
Tableau 26 : Tableau de synthèse de H-(Φ)10-RKLMEII-NH2 et de H-(Φ)10-RKLMEII-NH2 Le décrochage a été réalisé grâce au TFA/TIS/eau (95/2.5/2.5) pendant 4 heures.
Synthèse de H-(Φ)3-RKLMEII-NH2 (47), H-(Φ)5-RKLMEII-NH2 (48), H-(Φ)7-RKLMEII-NH2 (49) et H-(Φ)8-RKLMEII-NH2 (50)
Nous avons utilisé 500 mg de résine MBHA substituée à 0.9 mmol/g (0,45 mmol), l’agent de couplage pour toute la synthèse a été le BOP et nous avons utilisé 4 eq d’amino acide et 3 eq de Boc-ortho-OH. Après chaque couplage d’un résidu Boc-ortho-OH nous avons réalisé un capping par Ac2O. Les conditions de couplage sont résumées dans le Tableau 27.
n AA Dérivé Temps de couplage Eq quantité
1 Ile Boc-Ile-OH 2 x 1 Heure 4 448 mg
2 Ile Boc-Ile-OH 2 x 1 Heure 4 448 mg
3 Glu Boc-Glu(Ochx)OH 2 x 1 Heure 4 592 mg
4 Met Boc-Met-OH 2 x 1 Heure 4 448 mg
5 Leu Boc-Leu-OH 2 x 1 Heure 4 448 mg
6 Lys Boc-Lys(2ClZ)-OH 2 x 1 Heure 4 747 mg
7 Arg Boc-Arg(Tos)-OH 2 x 1 Heure 4 865 mg
8 à 10 ortho Boc-ortho-OH 5 Heures 3 357 mg
Le quart de la résine est prélevée soit 0.115 mmol et clivée pour donner H-(Φ)3-RKLMEII-NH2
11 et 12 ortho Boc-ortho-OH 5 Heures 3 268 mg
Le quart de la résine est prélevée soit 0.115 mmol et clivée pour donner H-(Φ)5-RKLMEII-NH2
13 et 14 ortho Boc-ortho-OH 5 Heures 3 179 mg
Le quart de la résine est prélevée soit 0.115 mmol et clivée pour donner H-(Φ)7-RKLMEII-NH2
15 ortho Boc-ortho-OH 5 Heures 3 90 mg
Le reste de la résine est clivé soit 0.115 mmol pour donner H-(Φ)8-RKLMEII-NH2