Les généralités présentées dans ce chapitre ne couvrent pas le large éventail de la synthèse peptidique en phase solide, mais la totalité des appareils, des stratégies de synthèse et des conditions de couplage qui ont été utilisés dans ce travail. Cela concerne aussi bien la synthèse des oligomères que des molécules hybrides du hCRF.
II 1 : Appareillages
II 1 1 : Réacteur manuel
Les synthèses peptidiques sont réalisées dans des réacteurs en verre cylindriques composés d’un fritté de porosité n°2 prolongé par un robinet de vidange et muni d’un bouchon à vis (Schéma 3). Le réacteur est fixé perpendiculairement à l’axe d’un moteur et l’agitation s’effectue par rotation. La vidange du réacteur est réalisée par aspiration et les effluents sont collectés dans un erlenmeyer faisant office de poubelle.
Schéma 3 : Réacteur manuel pour la synthèse peptidique en phase solide
Bouchon à vis Fritté Robinet de vidange Vide Poubelle
II 1 2 : Synthétiseurs automatisés II 1 2 1 : Synthétiseur Perseptive Pioneer
La résine est placée dans un réacteur cylindrique en verre fermé par deux frittés aux extrémités. Les réactifs et les solvants sont distribués sous atmosphère inerte (azote) et l’agitation de la résine se fait par flux continu.
II 1 2 2 : Synthétiseur Advance ChemTech (ACT)
La résine est placée dans des puits de synthèses dont le fond est composé d’un fritté. La distribution des réactifs et des solvants est réalisée sous atmosphère inerte par le haut du puit à l’aide d’un bras robot. L’agitation mécanique est transversale par vas et vient.
II 2 : Couplages
II 2 1 : Couplage au BOP
La résine est mise en suspension dans le DCM, on ajoute n+1 équivalents de DIEA par rapport à la charge de la résine, n équivalents d’acide aminé N-protégé, n équivalents de BOP. Le réacteur est agité pendant 30 minutes à plusieurs heures (en fonction de la difficulté de couplage). La solution de couplage est filtrée, la résine est lavée 3 fois au DCM, 2 fois à l’isopropanol, puis 3 fois au DCM.
II 2 1 : Couplage à l’HBTU
La résine est mise en suspension dans le DMF. On ajoute n+1 équivalents de DIEA par rapport à la charge de la résine, n équivalents d’acide aminé N-protégé, n équivalents de HBTU. Le réacteur est agité pendant 30 minutes à plusieurs heures (en fonction de la difficulté de couplage). La solution de couplage est filtrée, la résine est lavée 3 fois au DMF, 1 fois à l’isopropanol, puis 3 fois au DCM.
II 3 : Les stratégies de synthèse
Les deux stratégies de synthèse peptidique utilisées en phase solide (Boc et Fmoc) font appel à un même schéma : Accrochage du premier résidu N-protégé (par un Boc ou un Fmoc), déprotection de l’amine N-protégée, couplage d’un autre résidu N-protégé, etc. Le décrochage et la déprotection des chaîne lattérale est réalisé généralement lors de la même étape Schéma 4.
Schéma 4 : Schéma général de la synthèse peptidique en phase solide (X= O, NH)
II 3 1 : La stratégie Boc
Dans une stratégie Boc, les acides aminés ou les synthons sont protégés sur l’azote N terminal par un groupement temporaire de type tert-butyloxycarbonyle (Boc). Les chaînes latérales quant à elles, sont protégées par des groupements dits « orthogonaux » qui sont des
P N H C H C R 1 O X N H 2 C H C R 1 O X N H C H C R 2 O X O R 1 C C H N H N H C H C R 1 O P X O R 1 C C H N H P N H C H C R n O O
Premier amino-acide Résine
1) Déprotection 2) Lavages 1) Activation Couplage 2) Lavages Clivage de la résine et déprotection des chaînes latérales N H C H C R 2 O X H O R 1 C C H N H N H 2 C H C R n O O +
protections permanentes qui ne seront enlevées qu’en fin de synthèse. Le groupement Boc est éliminé par un traitement à l’acide trifluoroacétique (TFA). Les protections permanentes doivent résister à ce traitement ; on peut donc utiliser des groupements acidolabiles n’étant pas sensibles au TFA, ou des groupements basolabiles.
Les résines utilisés sont de deux types :
La résine MBHA (paraméthylbenzydrylamine) est une résine dite « amide » qui va conduire à l’obtention d’un peptide amide après décrochage de la résine. La résine est placée dans le réacteur, lavée au DCM, puis lavée pendant 5 minutes par un mélange DCM/DIEA afin de neutraliser le chlorhydrate et donc générer l’amine libre. Elle est ensuite lavée au DCM, MeOH et DCM.
La résine de Merrifield350 (chlorométhylpolystyrène) doit être fonctionnalisée par estérification en utilisant la méthode de Gisin351 pour ancrer le premier résidu. La résine est mise en présence du premier résidu N-protégé (Boc) qui est sous forme de sel de césium. Après 72 heures d’agitation dans le DMF à 55°C, la résine est filtrée, lavée puis séchée sous vide. Le taux de fonctionnalisation est évalué par gain de poids.
Elimination du groupement Boc :
La résine est traitée par un mélange TFA/DCM (50/50) pendant 2 minutes puis rincée par du DCM et traitée à nouveau pendant 28 minutes par le mélange TFA/DCM. La solution est filtrée, la résine est lavée 2 fois par du DCM, 2 fois par de l’isopropanol et deux fois par du DCM.
Décrochage du peptide et déprotection des chaînes latérales :
La résine est placée dans le réacteur en téflon d’une rampe à HF, sous agitation en présence d’1 ml d’anisole par gramme de résine. 10 ml de HF sont distillés sous vide et condensés dans le réacteur refroidi à l’azote liquide. On laisse le HF revenir à l’état liquide, puis le mélange est agité pendant 1 heure dans un bain de glace. Le HF est distillé sous vide et piégé dans un autre réacteur placé dans l’azote liquide. Le peptide totalement déprotégé est précipité dans l’éther et récupéré par filtration, il est ensuite solubilisé dans un mélange eau /acétonitrile /TFA (50/50/0.1), puis lyophilisé.
350
. Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154.
351
Gisin, B.F. Preparation of Merrifield resins through total esterification with cesium salts. Helv. Chim. Acta.
II 3 2 : La stratégie Fmoc
Dans une stratégie Fmoc, les acides aminés ou les synthons sont protégés sur l’azote N terminal par un groupement temporaire de type 9-fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc). Les chaînes latérales quant à elles, sont protégées par des groupements acidolabiles sensibles au TFA. Le groupement Fmoc est éliminé par un traitement à la pipéridine.
Avec une stratégie Fmoc, toutes les résines acidolabiles peuvent être utilisées, mais les plus employées sont généralement celles dont le peptide final est décroché par du TFA (Rink amide, Trityle).
La résine a été utilisée est une Rink amide352 protégée par un groupement Fmoc, il doit être éliminé. Pour cela la résine est traité par un mélange DMF/Pipéridine pendant 2 minutes puis rincée par du DMF et traitée à nouveau pendant 8 minutes par la solution de déprotection. La solution est filtrée, la résine est lavée 2 fois par du DMF, 2 fois par du méthanol et deux fois par du DCM.
Le décrochage du peptide est effectué en traitant pendant 2 à 5 heures (en fonction de la nature des protections des chaînes latérales) par un mélange TFA/DCM/TIS (49/49/2). Le mélange réactionnel est ensuite concentré sous vide, précipité à l’éther et récupéré par filtration. Comme pour la stratégie Boc, le peptide est ensuite solubilisé dans un mélange eau /acétonitrile /TFA (50/50/0.1), puis lyophilisé.
II 4 : Tests colorimétriques
Des tests colorimétriques spécifiques permettent de suivre l’avancement de la réaction de couplage ou de déprotection.
Le test de Kaiser353 :
Il permet de mettre en évidence la présence d’amines primaires libres présentes sur les billes de résine. Trois solutions sont préparés :
o Ninhydrine : 500 mg de ninhydrine sont dissous dans 10 ml d’éthanol. o Phénol : 80 g de phénol sont dissous dans 20 ml d’éthanol.
o KCN/Pyridine : 2 ml d’une solution aqueuse 0.001 M de cyanure de potassium sont ajoutés à 98 ml de pyridine.
Quelques billes de résine sont placées dans un tube en verre, une goutte de chaque solution est ajoutée. Le tube est chauffé 3 minutes a 120°C. En présence d’amines libres, les billes et la solution prennent une couleur violette sombre.
352
Rink, H. Solid-phase synthesis of protected peptide fragments using a trialkoxy-diphenyl-methylester resin. Tet. Lett., 1987, 28, 3787-3790.
353
Kaiser, E. ; Colescott, R.L. ; Bossinger, C.D. ; Cook, P.I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem., 1970, 34, 595-598.
Le test au TNBS354 :
Comme le test de Kaiser il permet de mettre en évidence les amines primaires libres. Les deux solutions de réactifs sont :
o DIEA à 10 % dans le DMF.
o Acide 2,4,6-trinitrobenzènesulfonique dans le DMF
Quelques billes de résine sont placées dans un tube en verre, une goutte de chaque solution est ajoutée. En présence d’amines libres, les billes prennent une couleur rouge-orangée.
Le test au chloranil355
Ce test permet de mettre en évidence la présence d’amines secondaires (ex : proline). Les deux solutions de réactifs sont :
o Acétaldéhyde à 2 % dans le DMF. o Chloranil à 2 % dans le DMF.
Quelques billes de résine sont placées dans un tube en verre, une goutte de chaque solution est ajoutée. En présence d’amines secondaires libres, les billes prennent une couleur verte.